Коронавирусная инфекция собак

     При коронавирусном энтерите, как и при других вирусных кишечных инфекциях точный диагноз ставят на основании лабораторных исследований свежих каловых масс.

     При отборе  проб необходимо соблюдать меры  личной безопасности. Все материалы (вата, физиологический раствор, аппликатор, пробирка и др.) должны быть стерильны. Материал от каждого животного отбирают отдельными инструментами.

Отбор фекалий: отбирают пробы массой 5- 20 г. И помещают в стерильный флакон или стерильный пластиковый контейнер. Отбор проводят во время или непосредственно перед дефекацией.

Окончательный диагноз можно поставить с помощью:

• Определения вирусных частиц с помощью электронной микроскопии или выделения вируса; исследуют свежие фекалии (не позднее 48 часов). Вирусные частицы очень нестабильны и разрушаются при длительном хранении, поэтому часты ложноотрицательные результаты

 

• Парной серологии, показывающей четырехкратное увеличение титров антител. Это позволяет поставить диагноз ретроспективно. Таких тест-систем нет в продаже; однако, можно использовать тест-системы для диагностики коронавирусной инфекции кошек после незначительной модификации.

     Так же для определения вируса используют: Реакцию связывания комплемента, Реакцию нейтрализации, Реакцию торможения гемагглютинации.  

11. Экспериментальное исследование:

В 1992- 1994 годах было проведено изучение причин распространения коронавирусной инфекции собак.

Материалы и методы:

     У владельцев 22 спонтанно заболевших собак  различного возраста уточняли  продолжительность, характер болезни и другие анамнестические данные. При этом исключали животных, заболевших парвовирусным энтеритом, посредством исследования проб кала с помощью коммерческого диагностического набора, а так же диареи алиментарного происхождения и отравления.

     Для выделения возбудителей болезни отобранный материал вносили в следующие виды первично- трипсинизированных и перевиваемых культур клеток6 клетки почки щенка (ПЩ), почки эмбриона свиньи (ПЭС) и их субкультуры, клетки куриных эмбрионов (ККЭ), эмбриона перепела (КЭП), семенников бычка, семенников бычка (СБ), перевиваемые линии клеток почки собаки (МДСК), почки кошки (CRFK), линию клеток подкожной опухоли собаки А-72. Культуры клеток поступили из лаборатории культур клеток института, а перевиваемая линия клеток А-72 из Испании, от доктора J. Duran. Для выращивания культур клеток использовали общепринятые в вирусологии питательные среды и растворы с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота.

     Суспензию  фекалий больных животных «осветляли»  центрифугированием, к надосадку добавляли антибиотики и вносили на сформированный клеточный монослой и культивировали в течение 5-7 суток в условиях термостата. Размножение оценивали по цитопатологическому эффекту (ЦПЭ). Для устранения токсической клеточной дегенерации делали три «слепых» пассажа.

     Параллельно  с этим клинический материал  и культуральные расплодки исследовали  под электронным микроскопом JEM- 100 CX методом негативного контрастирования (см. рис 1). Биопробу проводили на беспородных щенках (n=4) в возрасте до 5 мес. Животных заражали перорально культуральной вируссодержащей расплодкой, а трем контрольным щенкам аналогичного возраста выпаивали незараженную суспензию клеток. У животных брали пробу крови и выборочно проводили термометрию.

Результаты исследований: 

     Массовые диареи  у молодых собак с симптоматикой  характерной для коронавирусного  энтерита наблюдали весной и  осенью. При этом заболевание  быстро распространялось среди  восприимчивых животных, вероятно, посредством алиментарного пути заражения.

     У щенков  после отъема выраженность болезни  зависела от возраста, условий  содержания и иммунного статуса организма. У больных отмечали сонливость, подавленность, потерю аппетита и рвоту, фекалии были жидкими с характерным зловонным запахом, имели оранжевый оттенок, содержали слизь и примесь крови. Температура тела не повышалась. Большинство заболевших животных спонтанно выздоравливало через 7- 10 суток, в редких случаях заболевание продолжалось 2- 3 недели. Выздоровлению животных способствовали хорошие условия содержания и полноценное кормление.

     При внесении  в указанные культуры клеток, собранного от больных животных  материала установили, что наиболее  чувствительны культуры клеток  собачьего и кошачьего происхождения. Клетки этих культур уже на 2- 3и сутки приобретали продолговатую форму, позднее они округлялись. Центр очагов освобождался от дегенерированных клеток, и образовывались «окна». Обобщенные результаты исследований приведены в таблице 2.

Табл. 2 Чувствительность клеточных культур к выделенному изоляту вируса

Культура	Сроки появления ЦПД, сут	Степень           выраженности        ЦПД	Титр инфекционной активности, ТЦД50/мл
CRFK	3	+++	106,0
А-7	5	+++	106,0
МДСК	4	+++	106,5
ПЩ (первичная культура)	7	+++	105,75
ПЩ (субкультивированная культура)	7	+++	105,5
ПЭС	7	- - -	-
ККЭ	7	- - -	-
КПЭ	7	- - -	-
СБ	7	- - -	-

 

     Из нее видно, что используемые клеточные культуры  имели различную чувствительность  к вирусному изоляту. Используемый  изолят вируса на протяжении  пяти пассажей не размножался в культуре клеток почек эмбриона свиньи, семенниках бычка, фибробластах японских перепелов и фибробластах куриных эмбрионов. Инфекционная активность вируса в чувствительных культурах клеток после пятого пассажа составляла  от 105,5 до 106,5 ТЦД50/мл. Причем обработка изолята хлороформом приводила к резкому падению титра вируса  в чувствительных клеточных культурах.

Изолят вируса был кислотоустойчивым. У белых мышей и морских свинок болезнь не развивалась. Гемагглютинацию эритроцитов различных видов лабораторных животных изолят не вызывал.

     Электронно- микроскопические  исследования культуральной вирусологической  жидкости проводили методом негативного  контрастирования.  В качестве  красящего вещества  был использован 4% раствор фосфорно- вольфрамовой кислоты с рН 7. Просматривали препарат под электронным микроскопом JEM- 100 CX 11 с ускоряющим напряжением 80 кВ. В результате были обнаружены частицы, схожие по морфологическим признакам с коронавирусом. Частицы имели сферическую форму от 90 до 100 нм. Поверхность была покрыта выступами, образующими подобие солнечной короны, длина их составляла 15- 20 нм.

     Вирусом, прошедшим  пять пассажей в культуре клеток CRFK, экспериментально заразили четырех беспородных щенков  в возрасте до пяти месяцев (алиментарным путем в объеме 3 см3 активность вируса составляла 106,0  ТЦД50/мл). На третьи сутки после заражения у щенков отмечали угнетенное состояние, учащенную дефекацию, фекалии жидкой консистенции. При исследовании крови у зараженных животных не наблюдали существенных изменений количества форменных элементов  крови и лейкоцитарной формулы ( эритроциты 6,5- 7,3 млн./мкл, лейкоциты 9,0- 10,5 тыс./мкл). Температура тела оставалась в пределах нормы (38,6- 39,7 оС). На 6- 7е сутки три щенка пали с признаками диареи. При вскрытии у них отмечали обезвоживание организма, слизистая оболочка кишечника была утолщена, гиперемирована, с точечными кровоизлияниями и участками некроза. Гомогенат, полученный из тонкого отдела кишечника , был внесен в монослойную культуру клеток CRFK, и в течение 3 пассажей наблюдали характерную картину ЦПЭ.

Заключение:

     Выделен и  идентифицирован в культуре клеток  возбудитель, соответствующий по морфологии, культуральным и патогенным свойствам коронавирусу.

     На основании  проведенной работы можно сделать вывод, что одним из этиологических факторов, вызывающих энтериты собак является коронавирус.

 

Библиографический список:

1. Сюрин  В. Н., Фомина Н. В. Частная ветеринарная вирусология: справочная книга -М.:Колос, 1979.-427 с., ил.

2. Сюрин В. Н., Белоусова Р. В., Фомина Н. В. Ветеринарная вирусология: Учебник  для вузов- 2е изд., перераб. и доп.- М.: Агропромиздат, 1991. 431 с., ил.

3. Ольшанская А. А., Уласов В. И., Могильный Ю. И., Захарова Е. Д. Коронавирусный энтерит собак//Ветринария.- 1995.- № 6.- с. 57.

4. Белов А.Д., Данилов Е.П., Дукур И.И. и др. Болезни собак- М.: Колос, 1995.- 272 с.

5. Сулимов А.А., Уласов В.И. Вирусные болезни собак- М.: : КолосС, 2006.- 112 с., ил.

6. Букринская А. Г. Вирусология.- М.: Медицина, 1986.- 336., ил.