Половой режим самцов разных видов сельскохозяйственных животных и его физиологическое обоснование

Оценка спермы по активности.  Оценка свежеполученной спермы производят при температуре 40-420.  Для подогрева используют нагревательные столики (Морозова), которые крепятся на предметном столике микроскопа.  Оценка ведётся по 10- бальной шкале. При этом учитывают только спермии с прямолинейно – поступательным движением.  Если из 100 сперматозоидов 100 имеет прямолинейно – поступательное движение, то сперма оценивается баллом – 10.

Определение интенсивности дыхания спермиев по обесцвечиванию метиленовой синьки.  Метод основан на использовании спермиями кислорода синьки, добавленной в сперму, которая в результате этого обесцвечивается. На чистое предметное стекло наносят каплю свежеполученной спермы и в неё добавляют каплю 0,01% раствора метиленовой синьки. Стеклянной трубочкой обе капли перемешивают и набирают в неё смесь, так чтобы величина столбика была длиной 2 см.  Затем кладут трубку на лист белой бумаги и по секундомеру засекают время в течение которого наступит обесцвечивание голубого столбика.  Исследования проводят при температуре 20-220 С.

Глазомерная оценка спермы по густоте даст приблизительное представление о фактическом количестве спермиев в 1 мл спермы, что не обеспечивает рационального использования её, не  позволяет определить точную степень разбавления, а следовательно нормировать количество спермиев в дозе.   Для точного определения количества сперматозоидов в единице объёма и в эякуляте пользуются методом прямого подсчёта в счётных камерах с сетками Горяева, Бюркера, Тома.   Принцип их одинаков.

Определение концентрации спермы методом стандартов. Основан на оценке степени прозрачности спермы.   Спермии менее прозрачны, чем плазма, от их концентрации зависит прозрачность спермы.   Эти методы менее точны, так как на прозрачность спермы кроме спермиев оказывают влияние и другие факторы (красящие свойства кормов, эпителиальные клетки и другие).

Для определения концентрации спермы жеребца Паршутин Г.В. и Румянцева Е.Ю. предложили метод стандартов, состоящий из 6 небольших запаянных пробирок с прозрачной жидкостью, соответствующей степени прозрачности и определённой концентрации спермиев. К ним прилагается пробирка, в которую наливают 1,5-2 мл спермы.  Встряхнув стандарты, подбирают один из них сходный по прозрачности с исследуемой спермой.  Стандарт С.И.Сердюка предложен для определения концентрации спермы хряка.  Состоит из одной запаянной пробирки, прозрачность которой соответствует концентрации спермы 5 млн/мл.

Фотоэлектрокалориметрический метод определения концентрации спермы основан на способности мутной жидкости со взвешенными частицами поглощать свет прямо пропорционально числу этих частиц.  Степень поглощения пропускаемого через исследуемую жидкость светового пучка определяется в фотоэлектрокалориметре (ФЭК).  Для определения концентрации на ФЭК сначала строят калибровочную кривую.  Для этого берут пробы спермы с различной концентрацией спермиев и устанавливают в ФЭК их оптическую плотность, по которой в дальнейшем судят о концентрации спермиев исследуемых пробах.  Построенную градуированную кривую следует ежемесячно проверять, так как показания прибора могут меняться из-за старения фотоэлемента.

Также предложены методы подсчёта спермиев по величине их электрического сопротивления; подсчёт спермиев в сперме на скоростном автоматическом счётчике клеток – целлоскопе; подсчёт с использованием люминесцентных красителей и радиоактивных протонов.

Определение процента живых спермиев.  Глазомерная оценка по активности субъективна, поэтому В.А. Морозов предложил пользоваться окрашиванием спермы водными растворами эозина.  Живые и активные спермии не окрашиваются, а мёртвые и с колебательными движениями воспринимают окраску. Техника в следующем:

- на обезжиренное стекло  капают каплю спермы + каплю 5% раствора  эозина;

- перемешивают и делают  тонкий мазок;

- высохший мазок просматривают  под микроскопом. Мёртвые спермии  окрашиваются в розовый цвет.   Подсчитывают 500 спермиев.

Даже в  нормальной по качеству сперме есть некоторое количество патологических форм.  Обнаруживаются гигантские и карликовые спермии, с деформацией головки, с двумя головками, с подломом шейки, двухвостые, с закрученным хвостом и другие.  Большое количество анормальных спермиев в сперме указывает на нарушение спермиогенеза, вредное влияние секретов придаточных половых желез или  на нарушение правил получения  и хранения спермы. Большое значение в образовании патологических форм спермиев имеет нарушение терморегулирующие функции мошонки.

Наиболее существенные, часто встречающиеся патологические изменения спермы – азооспермия, олигоспермия, некроспермия и тератоспермия.  Эти изменения спермы являются характерными проявлениями или признаками различных форм импотенции (врождённой, старческой, симптоматической, алиментарной, эксплуатационной). Азооспермия – отсутствие спермиев в эякуляте. При азооспермии спермии в семенниках не образуются. Азооспермия развивается при крипторхизме, недоразвитии семенников, дегенеративных процессах в семенниках на почве неправильного и однообразного кормления и перенесения общих заболеваний и заболеваний семенников, при чрезмерной эксплуатации производителей.  Азооспермия обусловлена также непроходимостью выводящих путей в результате двустороннего воспаления придатков семенников или спермиопроводов.

Олигоспермия – переходное состояние к азооспермии или появлению спермиев в результате восстановления спермиогенеза. При олигоспермии в сперме имеется небольшое количество спермиев, иногда с хорошей подвижностью, но плохой выживаемостью.

Некроспермия – неподвижность спермиев в свежеполученной сперме. Причин, вызывающих некроспермию, очень много. Чаще всего она возникает на почве нарушения функций придатков семенников.  Тератоспермия – появление большого количества патологических (уродливых) форм спермиев.

Техника определения патологий состоит в следующем:

- на протёртое предметное  стекло наносят каплю спермы;

- делают мазок, сушат на  воздухе и фиксируют  960 спирте, который наносят пипеткой;

- ополаскивают водой, окрашивают  раствором фуксина, метиленовой  краской и другим красителем  – 3-5 минут;

- краску смывают водой, мазок сушат и ведут подсчёт  при увеличении в 500-600 раз;

- подсчитывают 600 спермиев, учитывая нормальные и патологические  формы, в нескольких полях зрения и исчисляют процент патологических форм спермиев.

 Все исследования спермы  проводят при строгом соблюдении  действующих стандартов и инструкций  по искусственному осеменению  сельскохозяйственных животных.  Производителя можно использовать  для естественного или искусственного  осеменения, если его сперма соответствует  требованиям действующей инструкции  по искусственному осеменению животных.

73. Методы получения трансгенных  животных и его перспективы. 

 Трансгенные животные - это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генетическая информация (трансген). Трансгеноз — экспериментальный перенос генов, выделенных из определенного генома или искусственно синтезированных, в другой геном. Животные, в геном которых интегрируют чужеродные гены, называют трансгенными. В ряде экспериментов было установлено, что мыши, развивающиеся из зиготы, в которую была введена чужеродная ДНК, содержат в своем геноме фрагменты этой ДНК, а иногда у них происходит и экспрессия чужеродных генов. Лучшие результаты были получены при микроинъекции рекомбинантной ДНК в мужской более крупный пронуклеус. Метод микроинъекции чужеродной ДНК в мужской пронуклеус зиготы используется в настоящее время у всех млекопитающих, включая сельскохозяйственных животных.

Успешные опыты с мышами способствовали проведению работ по получению трансгенных кроликов и сельскохозяйственных животных.

Схема получения трансгенных животных в основном такая же, как и при работе с мышами. Она состоит из следующих этапов:

1) выбор, получение  и клонирование чужеродного гена;

2) получение зигот  и выявление пронуклеусов;

3) микроинъекция  определенного числа копий генов  в видимый пронуклеус;

4) трансплантация  зиготы в половые пути гормонально  подготовленной самки;

5) оценка родившихся.

 Животных по генотипу и фенотипу: интеграция чужеродной ДНК, экспрессия ДНК, влияние на признак (например, высокая интенсивность роста), установление наследования гена. 
Наиболее трудной проблемой в опытах по переносу генов в ткани или организмы животных оказалась экспрессия внесенных генов. Выяснилось, что только четыре промотора (генов металлотионеина, трансферрина, иммуноглобулина, эластазы) из многих исследованных способны активировать присоединенные к ним гены. 
Трансгенные кролики были получены Р. Хаммером и Г. Бремом. Они производили микроинъекцию в пронуклеусы кроликов гена гормона роста человека. В нашей стране в отделе биотехнологии ВИЖа получена трансгенная крольчиха с интеграцией и экспрессией гена гормона роста крупного рогатого скота. В Австралии получили первых в мире трансгенных овец. В возрасте 2—4 лет трансгенные овцы в 1,5 раза превосходили по массе сверстников той же породы. Австралийские ученые предполагают ввести овцам и другие гены, которые должны привести к ускорению роста шерсти, усилению резистентности к болезням. 
Трансгенные свиньи впервые были получены в лабораториях Р. Хаммера (1985) и Г. Брема (1986) на основе инъекции гормона роста человека. У некоторых таких свиней в плазме крови отмечался высокий уровень гормона роста человека. В нашей стране получены трансгенные свиньи на основе инъекции в зиготы гена гормона роста крупного рогатого скота. 
 
При работе с крупным рогатым скотом, для того чтобы обнаружить пронуклеусы, применяют ДНК-специфические флуоресцентные окраски и центрифугирование зигот.

В 1987 г. родился первый трансгенный теленок молочно-мясного типа. 
В порядке совершенствования процесса трансгеноза разрабатывается метод оплодотворения яйцеклеток с помощью микроинъекции одного сперматозоида с включенной в него чужеродной ДНК. 
В перспективе предполагается получение трансгенных животных для производства новых продуктов, которые можно будет производить в промышленном масштабе, если они будут полезны с медицинской точки зрения. С этой целью будет использоваться рекомбинантная ДНК, с помощью которой от трансгенных животных будут получать, например, из коровьего молока, крови или печени такие белки, как инсулин человека, интерферон и гормоны. Разрабатывается биотехнология производства фактора свертывания крови из молока трансгенных овец. Предполагается, что фактор свертываемости, необходимый для лечения гемофилии, будет синтезироваться в клетках молочной железы овец и переходить в молоко. 
Развитие биотехнологии сельскохозяйственных животных, в том числе генная инженерия, открывает новые возможности развития животноводства. Уже имеющиеся результаты по получению трансгенных животных говорят о возможности изменения ряда важнейших хозяйственно-ценных признаков. Например, трансгенные животные (свиньи, куры, кролики) с геном гормона роста при равных условиях характеризуются повышенными темпами роста.

Другим важнейшим направлением генной инженерии является получение трансгенных особей с интегрированными в геном генными конструкциями, связанными с усилением иммунитета животных к инфекционным заболеваниям.

Третьим актуальным направлением генной инженерии животныж является получение животных продуцентов биологически активных веществ, необходимых в медицине, ветеринарии и технологии переработки продуктов животноводства. Многие биологически активные вещества не могут производиться традиционными методами в достаточных количествах и с желательным качеством. За неполные десять лет, прошедшие с американского достижения, от трансгенных коз, овец, свиней, кроликов и даже коров было получено семнадцать лекарственных белков. Причем десять из этих белков выделялись с молоком в приличной концентрации - около одного грамма на литр молока. Это большое количество, поскольку для курса лечения некоторых болезней требуется всего несколько миллиграммов. А сейчас таким способом научились синтезировать гораздо больше белков. Как минимум три препарата, полученных от трансгенных животных, проходят сегодня последние клинические испытания.

Наиболее интересным является использование молочной железы как продуцирующего органа, так как в этом случае жидкость, содержащую рекомбинантные протеины, можно легко извлечь. Кроме того, молочная железа физиологически обладает огромным потенциалом синтеза протеинов. При получении трансгенных животных исследователи стремятся к тому, чтобы все соматические клетки и, в особенности, генеративные клетки, содержали генную конструкцию. В этих случаях интеграция рекомбинантной ДНК приводит к полной трансгенности и при условии достаточной экспрессии обусловливает изменение фенотипа животных и передачу этого признака потомству. Основным способом получения трансгенных животных на сегодняшний день остается микроинъекция рекомбинантной ДНК в мужской пронуклеус ранних зигот. Поэтому микроинъекцию генов осуществляют на максимально ранних этапах развития животного: в большинстве случаев на стадии оплодотворенной яйцеклетки или двуклеточных эмбрионов. Уже имеются трансгенные по гену химозина кролики с промотором казеина крупного рогатого скота, в молоке  которых отмечен высокий уровень химозина и доказана его высокая активность. У некоторых кроликов в 1л молока содержится до 1500 мг химозина, а за лактацию от одного кролика можно получить такое количество химозина, которое способно переработать до 10000 кг коровьего молока. Если учесть, что для свертывания 1 тонны молока при производстве сыра требуется 1 г химозина, то для производства сыра в России потребуется лишь 300 кг химозина.