Клеточная и генная инженерия

полипептида и одну молекулу двуцепочечной ДНК, ассоциирован-

ную с четырьмя видами гистоновых белков. Определена полная

нуклеотидная последовательность ДНК вируса. Ее длина 5243 пары

нуклеотидов, при этом в  она кодирует структуру 6 различных  бел-

ков. Три из них входят в состав капсида, а еще три выполняют регу-

ляторную функцию при репликации вирусной ДНК и ее трансфор-

мации в клетку-хозяина.

На основе этого вируса были созданы рекомбинантные моле-

кулы, состоящие из ДНК вируса и ДНК невирусной природы, но

способные проникать в  эукариотические клетки. Следовательно, эти

молекулы могут быть векторами  для введения чужеродных генов в

клетки млекопитающих. Так  в ДНК вируса SV 40 был встроен  ген

глобина кролика, который  затем экспрессировался в линии клеток

обезьяны, зараженных рекомбинантным вирусом. В зараженных

клетках синтезировалась м - РНК гена глобина и происходила ее

трансляция с образованием биологически активного

глобинакролика.Яйцеклетка  и   эмбрионы   млекопитающих  используются   для введения в них чужеродных генов. Если инъецировать ген глобина

кролика в мужской пронуклеус яйца мыши, то в плазме крови неко-

торых новорожденных мышат можно обнаружить глобин кролика.

 

 Методы получения  химер. 

Успешна пересадка эмбрионов  может быть осуществленатолько между самками одного вида. Пересадка эмбрионов, например, овцам и козам и наоборот сопровождается их приживляемостью, но не завершается рождением потомства. Во всех случаях межвидовых беременностей непосредственной причиной абортов является нарушение функции плаценты, по-видимому, за счет иммунологической реакции материнского организма на инородные антигены плода. Эта несовместимость может быть преодолена получением химерных эмбрионов с помощью микрохирургии..

Сначала были получены химерные животные путем объединения бластомеров  из эмбрионов одного вида. С этой целью получали сложные химерные эмбрионы овец объединением 2-, 4-, 8-клеточных  эмбрионов. Каждый сложный объединенный эмбрион состоял из равного числа  бластомеров эмбрионов от 2 – 8 родителей. При этом общее число клеток колебалось от четырех- до восьмикратного увеличения нормального числа клеток. Эмбрионы вводили в агар и переносили в лигатированные  яйцеводы овец для развития до стадии ранней бластоцисты. Нормально развивающиеся бластоцисты пересаживали реципиентам и получили живых ягнят, большинство из которых оказались химерными по данным анализа крови и внешним признакам.

Получены химерные овцы путем  инъекции внутренней клеточной массы, выделенной иммунохирургическим путем из эмбрионов доноров в бластоцисты эмбрионов реципиентов. Зону пеллюциду у бластоцист доноров удаляли инкубированием в 0,5%-ной проназе и пептированием.

Для восстановления их функции  после обработки проназой эмбрионы культивировали в течение 3 ч. Затем эмбрионы без прозрачной оболочки культивировали в течение 1 ч в антисыворотке к клеткам печени овцы, три раза отмывали и помещали в раствор (1:4) сыворотки крови морской свинки на 1 ч. Лизированные клетки трофобласта удаляли пипетированием, а изолированную внутреннюю клеточную массу вводили проколом инъекционной пипетки через зону пеллюциду в трофобласт бластоцисты реципиента. После пересадки этих бластоцист получены химерные ягнята как по признакам групп крови, так и по внешним признакам.

Получены химеры и у  крупного рогатого скота (Г. Брем и др., 1985) соединением половинок 5 – 6,5-дневных  эмбрионов. Пять из семи телят, полученных после нехирургической пересадки  агрегированных эмбрионов, не имели  признаков химеризма. Один теленок был химерой двух пород – бурой швицкой и голштинофризской. Однако масть бурой швицкой породы доминировала. Анализ крови этого теленка показал присутствие групп крови только от родителей голштинофризской породы. Другой теленок был химерой неопределенного происхождения.

Показана высокая эффективность  получения химер крупного рогатого скота объединением морул без  зоны пеллюциды. Авторы получили химеры крупного рогатого скота с «двойной мускулатурой». В этих исследованиях показано, что передача химерам родительского типа имеет случайный характер, т.е. потомство может развиваться из клеток, происходящих или от любого эмбриона, или от сочетания эмбрионов. Половина всех химер представляет собой интерес.

Наиболее показательно получение  химер от объединенных частей эмбрионов  разных видов, например, овцы и козы.

Исследования С.В. Фехилли и др. (1984) показали, что бластомеры овцы и козы, заключенные в агар и помещенные на 4 – 5 сут в лигатированный яйцевод овцы, могут формировать комбинированные бластоцисты. Эти бластоцисты жизнеспособны и могут развиваться до рождения нормального потомства. В первом опыте в результате объединения по одному бластомеру из 4-клеточных эмбрионов овцы и козы получено 17 бластоцист, пересадка которых завершилась получением семи потомков. Все потомки были похожи в основном на ягнят, но у трех из них руно имело поперечные валики и лоскуты волос, резко контрастирующие с плотно вьющейся шерстью.

 

Методы трансплантации эмбрионов.

 

Трансплантация эмбрионов  женским особям сравнима по возможностям с техникой искусственного осеменения, позволяющей полнее использовать генотип  выдающихся самцов. Однако широкое внедрение этой перспективной технологии сдерживается несовершенством методов получения большого числа зрелых, полноценных, способных к оплодотворению ооцитов (Y. Koinig., 1980), а также сравнительно высокой трудоемкостью и стоимостью работ (В.В. Мадисон, В.Л. Мадисон, 1988).

В странах СНГ работы по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота начаты в 1975 г. Первые телята были получены в начале 1977 г. (М.И. Прокофьев и соавт., 1977) во Всесоюзном НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных, а первый теленок от пересадки замороженного эмбриона во Всесоюзном институте животноводства в 1980 г. С 1983 года организованы четыре центра трансплантации эмбрионов: ВИЖ, ВНИИРГЖ, НИИЖ Лесостепи и Полесья. УССР, Украинский НИИ разведения и искусственного, осеменения крупного рогатого скота (Н.З. Жильцов, В.В. Мадисон и соавт., 1986). Мировая практика пересадки эмбрионов успешно развивается. Применение метода трансплантации эмбрионов непрерывно растет. При этом технология технически совершенствуется, а эффективность метода возрастает (Ф.И. Осташко, 1995; Т.И. Шкиль, 1995; Ф.С. Мауссе, 1999; М.Л. Дибиров, 2000).

В настоящее время наиболее эффективен нехирургический метод  трансплантации эмбрионов. В среднем  на современном уровне биотехнологи получают с применением пересадки эмбрионов около 10 телят, а в отдельных случаях до 50 телят от одного донора в год, тогда как при обычном способе размножения (искусственном осеменении) корова за всю жизнь могла бы воспроизвести 7–8 телят. Поэтому идея получения максимального числа потомков от лучших по продуктивности самок издавна привлекала внимание исследователей. Решение этой проблемы стало возможным на основе применения метода трансплантации эмбрионов (Ю.Д. Клинский, 1978, 1980; Н.И. Сергеев, 1979,1984; М.И. Прокофьев, 1983).

 Эмбрион крупного рогатого  скота можно извлечь из матки на определенной стадии развития и разделить на 2, или даже 4 части. Затем эти части помещают в матку четырех разных коров и он рождают 4 генетически идентичных телят. Однако, в этих экспериментах клонировался эмбрион (похожие процессы происходят и естественным путем, например при рожде-

нии однояйцевых близнецов). В случае же пересадки ядер была

клонирована взрослая особь. Подобные работы играют важное зна-

чение в сельском хозяйстве, так как позволяют получить значитель-

но большее число высокопродуктивных элитных животных.

В последние годы в ряде стран изучают вопрос о возможности  переноса заразных болезней путем эмбриональной  пересадки реципиентам от коров-доноров. Ряд зарубежных авторов считают, что методом трансплантации эмбрионов  можно успешно вести борьбу со многими инфекционными болезнями. По некоторым опубликованным данным отдельные инфекции, например, инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея, блутанг, лейкемия крупного рогатого скота реципиентам с трансплантируемым зародышем от больного донора не передаются (R.A. Bowen et al., 1983; Е. Singh et al., 1983; Z. Pokorny et al., 1983; L. Elizabeth, 1984).

По данным французских  исследователей, вирус лейкоза крупного рогатого скота и вирус катаральной  лихорадки при эмбриотрансплантации не передаются через эмбрионы с интактной зоной пеллюцида, если их до пересадки промыть раствором трипсина (W.C. Наге, 1984).

Несмотря на достигнутые  успехи в разработке приемов вызывания  множественной овуляции у коров  и телок-доноров эмбрионов, технике  извлечения и пересадке зародышей, выход полноценных эмбрионов  и их приживляемость не стабильна.

Многие вопросы теории и практики требуют дальнейшего  изучения и совершенствования.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение 

 

В заключение следует сказать  несколько слов о перспективах 

генной   инженерии , которые просто фантастичны. На основе деталь-

ного анализа возможностей  и  реальных достижений генной инжене-

рии составлены научные прогнозы на начало XXI века. Высказаны,

например, надежды, что к 2006 году будут разработаны препараты

для лечения такого опасного заболевания, как СПИД, к 2009 году

будут определены гены, которые  связаны со злокачественными но-

вообразованиями, а к 2010 году будут установлены механизмы поч-

ти всех видов рака. К 2013 году завершится разработка препаратов,

предотвращающих рак.

Проделанная работа позволяет  сделать вывод о том, что на технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают  экспрессию генов в тканях, локализацию  генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды  также используются в диагностике  различных заболеваний. Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным  нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный  ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом, можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Генетическая трансформация  животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Сейчас, даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

 В настоящее время в ряде стран, в том числе и в России, раз-

рабатывается международная программа Геном человека, которая

сулит важные открытия в  биологии человека, в эволюции, биологии

развития и нейробиологии.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Биотехнология / Под ред.А.А.Баева // М.: Наука, 1984. - 257 с.

2. Биотехнология / Учебное  пособие для вузов. В 8 кн. / Под

ред.Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова. Кн.3: Клеточная инженерия /

Р.Г.Бутенко, М.В.Гусев, А.Ф.Киркин, Т.Г.Корженевская,

Е.Н.Макарова // М.: Высшая школа, 1987. - 127 с.

3. Вакула В.Л. Биотехнология: что это такое? // М.: Молодая гвар-

дия, 1989. - 301 с.

4. Егоров Н.С. Биотехнология: проблемы и перспективы // М.: Выс-

шая школа, 1987.

5. Квасницкий А.В. Трансплантация эмбрионов и генетическая инженерия в животноводстве. /Квасницкий А.В., Мартыненко Н.А., Близнюченко А.Г. – Киев- Урожай, 1988.- 264с.

6. Лещинская И.Б. Генетическая инженерия // Соросовский образо-

вательный журнал. - 1996. - N1. - С.32-39.

7. Льюин Б. Гены // М.: Мир, 1987. - 544 с.

8. Мишутин И.Ф., Шевченко М.И. Этюды о биотехнологии // Киев:

Наукова думка, 1989. - 152 с.

9. Промышленная биотехнология  и успехи генетической инженерии

// М.: Мир, 1984. - 176 с.

10. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды // М.: Мир,

1987. - 411 с.

11. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК // М.: Мир,

1986. - 288 с.