Свойства ферментов

vi / V = [ES] / [E]T

поскольку для общей концентрации фермента справедливо

[E]T = [E] + [ES] + [EI]

то 1 / vi = (Ks / V[S]) (1 + [I] / KI) + 1 / V

Очевидно, если [I] = KI, то наклон прямой линии становится вдвое больше, чем для зависимости 1/v0 от [S] (v0 - скорость ферментативной реакции в отсутствие ингибитора).

     Тип ингибирования обычно определяют графически. Конкурентное ингибирование легче всего распознается путем построения графиков Лайнуивера - Берка (т.е. графиков в координатах 1/vi и 1/[S]) при разных концентрациях ингибитора. При истинном конкурентном ингибировании получается набор прямых, отличающихся тангенсом угла наклона и пересекающих ось ординат (ось 1/vi) в одной точке. При любой концентрации ингибитора можно попользовать настолько высокую концентрацию субстрата, что активность фермента будет максимальной.

     На принципе конкурентного ингибирования основано действие многих фармакологических препаратов, ядохимикатов, используемых для уничтожения сельскохозяйственных вредителей, и боевых отравляющих веществ. Например, группа антихолинэстеразных препаратов, к которым относятся производные четвертичных аммониевых оснований и фосфорорганические соединения, являются конкурентными ингибиторами фермента холинэстеразы по отношению к его субстрату ацетилхолину. Холинэстераза катализирует гидролиз ацетилхолина - медиатора холинэргических систем (нервно-мышечных синапсов, парасимпатической системы и т.д.). Антихолинэстеразные вещества конкурируют с ацетилхолином за активный центр фермента, связываются с ним и выключают каталитическую активность фермента. Такие препараты, как прозерин, физостигмин, севин, угнетают фермент обратимо, а фосфорорганические препараты типа армина, нибуфина, хлорофоса, зомана действуют необратимо, фосфорилируя каталитическую группу фермента. В результате их действия накапливается ацетилхолин в тех синапсах, где он является медиатором нервного возбуждения, т.е. происходит отравление организма накопившимся ацетилхолином. Действие обратимых ингибиторов постепенно проходит, так как чем больше накапливается ацетилхолина, тем быстрее он вытесняет ингибитор из активного центра холинэстеразы. Токсичность необратимых ингибиторов несравненно выше, поэтому их применяют для борьбы с вредителями сельского хозяйства, бытовыми насекомыми и грызунами (например, хлорофос) и как боевые отравляющие вещества (например, зарин, зоман и др.).

       3.5.2 Неконкурентное ингибирование. При неконкурентном ингибировании специфический ингибитор не влияет на константу диссоциации комплекса фермент-субстрат. С другой стороны, максимально достижимая скорость реакции меньше в присутствии ингибитора, чем в его отсутствие, даже при бесконечно большом избытке субстрата. Наличие ингибирования доказывает, что ингибитор связывается с белком. Неизменность константы диссоциации как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора в свою очередь указывает на то, что в отличие от субстрата ингибитор связывается с другой группой. С теоретической точки зрения, механизм подобного ингибирования может быть интерпретирован различными способами: а) центр связывания и каталитический центр фермента различны. В этом случае ингибитор, связанный с каталитическим центром, уменьшает активность фермента и максимально достигаемую 
скорость, не влияя на образование комплекса фермента с субстратом;  б) центр связывания и каталитический центр перекрываются на 
поверхности фермента, а ингибитор связывается с другими группами белка. Благодаря связыванию ингибитора с поверхностью фермента информация белка изменяется и становится неблагоприятной для осуществления катализа;  в) ингибитор не связывается ни с каталитическим центром, ни с центром связывания, и при этом не влияет на конформацию белка. Тем не менее, он может локально изменять распределение заряда на участке поверхности белка. Ингибирование активности может происходить и в этом случае, если, например, делается невозможной ионизация групп, существенных для проявления активности, или, если наоборот происходит ионизация групп, активных только в неионизованной форме. Такое явление наблюдается главным образом при использовании сильнокислых или сильнощелочных реагентов.

     Ингибитор и субстрат не влияют на связывание друг друга с ферментом, но комплексы фермента, содержащие ингибитор, совершенно неактивны. В таком случае можно предположить следующие элементарные стадии:

vi / V = [ES] / [E]T

[E]T = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]

1/ vi = (Ks / V [S]) (1 + [I] / KI) + (1 / V) (1 + [I] / KI)

Если [I] = KI величины наклонов прямых и ординаты точки пересечения с вертикальной осью удваиваются по сравнению с 1/v0.

     Неконкурентными ингибиторами являются, например, цианиды, которые прочно соединяются с трехвалентным железом, входящим в каталитический участок геминового фермента - цитохромоксидазы. Блокада этого фермента выключает дыхательную цепь, и клетка погибает. К неконкурентным ингибиторам ферментов относятся ионы тяжелых металлов и их органические соединения. Поэтому ионы тяжелых металлов ртути, свинца, кадмия, мышьяка и других очень токсичны. Они блокируют, например, SH-группы, входящие в каталитический участок фермента.

     Снять действие неконкурентного ингибитора избытком субстрата (как действие конкурентного) нельзя, а можно лишь веществами, связывающими ингибитор - реактиваторы.

     Неконкурентные ингибиторы применяются как фармакологические средства, отравляющие вещества для борьбы с вредителями сельского хозяйства и в военных целях. В медицине применяются препараты, содержащие ртуть, мышьяк, висмут, которые неконкурентно ингибируют ферменты в клетках организма или болезнетворных бактерий, чем и определяется тот или иной их эффект. При интоксикации связывание яда или его вытеснение из комплекса фермент - ингибитор возможно с помощью реактиваторов. К ним относятся все SH-содержащие комплексоны (цистеин, димеркаптопропанол), лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота и др.

     3.5.3 Бесконкурентное ингибирование. Этот тип ингибирования в литературе называют также антиконкурентным или сопряженным ингибированием, однако термин «бесконкурентное ингибирование» используется наиболее широко. Характеристикой этого типа ингибирования является то, что ингибитор не способен присоединяться к ферменту, но он присоединяется к комплексу фермент-субстрат.

В случае бесконкурентного ингибирования комплекс, содержащий ингибитор, неактивен:

vi / V = [ES] / [E]

[E]T = [E] + [ES] + [ESI]

1/ vi = Ks / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / KI)

     3.5.4 Субстратное ингибирование. Субстратным ингибированием называется торможение ферментативной реакции, вызванное избытком субстрата. Такое ингибирование происходит вследствие образования фермент-субстратного комплекса, не способного подвергаться каталитическим превращениям, Комплекс ES2 непродуктивный и делает молекулу фермента неактивной. Субстратное торможение вызвано избытком субстрата, поэтому снимается при снижении его концентрации.

     3.5.5 Аллостерическое ингибирование. Аллостерическая регуляция характерна только для особой группы ферментов с четвертичной структурой, имеющих регуляторные центры для связывания аллостерических эффекторов. Отрицательные эффекторы, которые тормозят превращение субстрата в активном центре фермента, выступают в роли аллостерических ингибиторов. Положительные аллостерические эффекторы, напротив, ускоряют ферментативную реакцию, и поэтому их относят к аллостерическим активаторам. Аллостерическими эффекторами ферментов наиболее часто выступают различные метаболиты, а также гормоны, ионы металлов, коферменты. В редких случаях роль аллостерического эффектора ферментов выполняют молекулы субстрата.

     Механизм действия аллостерических ингибиторов на фермент заключается в изменении конформации активного центра. Снижение скорости ферментативной реакции является либо следствием увеличения Km, либо результатом снижения максимальной скорости Vmax при тех же насыщающих концентрациях субстрата, т.е. фермент частично работает вхолостую.

     Аллостерические ферменты отличаются от прочих ферментов особой S-образной кривой зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. Эта кривая сходна с кривой насыщения гемоглобина кислородом, она свидетельствует о том, что активные центры субъединиц функционируют не автономно, а кооперативно, т.е. сродство каждого следующего активного центра к субстрату определяется степенью насыщения предыдущих центров. Согласованную работу центров обусловливают аллостерические эффекторы.

     Аллостерическая регуляция проявляется в виде ингибирования конечным продуктом первого фермента цепи. Строение конечного продукта после серии превращении исходного вещества (субстрата) не похоже на субстрат, поэтому конечный продукт может действовать на начальный фермент цепи только как аллостерический ингибитор (эффектор). Внешне такая регуляция сходна с регуляцией по механизму обратной связи и позволяет контролировать выход конечного продукта, в случае накопления которого прекращается работа первого фермента цепи. Например, аспартат-карбамоилтрансфераза (АКТаза) катализирует первую из шести реакций синтеза цитидинтрифосфата (ЦТФ). ЦТФ - аллостерический ингибитор АКТазы. Поэтому, когда накапливается ЦТФ, происходит торможение АКТазы и прекращается дальнейший синтез ЦТФ. Обнаружена аллостерическая регуляция ферментов с помощью гормонов. Например, эстрогены являются аллостерическим ингибитором фермента глутаматдегидрогеназы, катализирующего дезаминирование глутаминовой кислоты.

     Таким образом, даже простейшее кинетическое уравнение ферментативной реакции содержит несколько кинетических параметров, каждый из которых зависит от температуры и среды, в которой протекает реакция.

    

4. ВИДЫ КИНЕМАТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

    

     Различают стационарную, предстационарную и релаксационную кинетику ферментативных реакций.

   

     4.1 Стационарная кинетика. В стационарном состоянии по промежуточным соединениям (dXi/dt = 0, i = 1, ..., n) и при избытке субстрата , где [S]0 и [E]0 - начальные концентрации соотв. субстрата и фермента, кинетика процесса характеризуется постоянным, неизменным во времени уровнем концентраций промежуточных соединений, а выражение для скорости процесса v0, наз. начальной стационарной скоростью, имеет вид (уравнение Михаэлиса- Ментен):

(1)

где значения kкат и Км - функции констант скорости элементарных стадий и заданы уравнениями:

Величину kкат называют эффективной каталитической константой скорости процесса, параметр Км - константой Михаэлиса. Значение kкат определяется величинами ki наиб. медленных стадий каталитич. р-ций и иногда наз. числом оборотов фермента (ферментной системы); kкат характеризует число каталитических циклов, совершаемых ферментной системой в единицу времени. Наиб. распространены ферменты, имеющие значение kкат. для специфических субстратов в диапазоне 102-103 с-1. Типичные значения константы Михаэлиса лежат в интервале 10-3- 10-4 M.

     При больших концентрациях субстрата, когда то есть скорость реакции не зависит от концентрации субстрата и достигает постоянной величины, наз. макс. скоростью. Графически уравнение Михаэлиса - Ментен представляет собой гиперболу. Его можно линеаризовать, используя метод двойных обратных величин (метод Лайнуивера - Берка), то есть строя зависимость 1/v от 1/[S]0, или другие методы. Линейная форма уравнения (1) имеет вид:

(2)

Она позволяет определить графически значения Км и vмакс (рис. 14).

Рис. 14 График линейной трансформации уравнения Михаэлиса - Ментен в двойных обратных величинах (по Лайнуиверу - Берку).

Величина Км численно равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна , поэтому Км часто служит мерой сродства субстрата и фермента, однако это справедливо лишь, если

     Величины Км и vm изменяются в зависимости от значений рН. Это связано со способностью участвующих в катализе групп молекулы фермента изменять свое состояние ионизации и, тем самым, свою каталитическую эффективность. В простейшем случае изменение рН приводит к протонированию или депротонированию, по крайней мере, двух ионизирующихся групп фермента, участвующих в катализе. Если при этом только одна форма фермент-субстратного комплекса (напр., ESH) из трех возможных (ES, ESH и ESH2) способна превращаться в продукт реакции, то зависимость скорости от рН описывается формулой:

где f = 1 + [H+]/Kа + Kb /[H+] и f ' = 1 + [H+]/К'а + K'b/[H+] – так называется рН-функции Михаэлиса, а Ка, Кb и К'a, K'b - константы ионизации групп а и b соответственно свободного фермента и фермент-субстратного комплекса.

     В координатах lg kкат - рН эта зависимость представлена на рис. 15, причем тангенсы углов наклона касательных к восходящей, независимой от рН и нисходящей ветвям кривой должны быть равны соответственно +1, 0 и -1. Из такого графика можно определить значения рКа групп, участвующих в катализе.

Рис. 15 Зависимость каталитической константы от рН в логарифмических координатах.

     Скорость ферментативной  реакции не всегда подчиняется  уравнению (1). Один из часто встречающихся случаев - участие в реакции аллостерических ферментов, для которых зависимость степени насыщения фермента от [S]0 имеет негиперболический характер (рис. 16). Это явление обусловлено кооперативностью связывания субстрата, то есть когда связывание субстрата на одном из участков макромолекулы фермента увеличивает (положительная кооперативность) или уменьшает (отрицательная кооперативность) сродство к субстрату другого участка.

Рис. 16 Зависимость степени насыщения фермента субстратом от концентрации субстрата при положительной (I) и отрицательной (II) кооперативности, а также в ее отсутствии (III).

    

    4.2  Предстационарная кинетика. При быстром смешении растворов фермента и субстрата в интервале времен 10-6-10-1 с можно наблюдать переходные процессы, предшествующие образованию устойчивого стационарного состояния. В этом предстационарном режиме при использовании большого избытка субстрата система дифференцированных уравнений, описывающая кинетику процессов, линейна. Решение данного типа системы линейных дифференцированных уравнений дается суммой экспоненциальных членов. Так, для кинетической схемы, представленной выше, кинетика накопления продукта имеет вид:

где Ai-, b, аn - функции элементарных констант скорости; -корни соответствующего характеристического уравнения.

Величина, обратная , называется  характеристическим временем процесса:

Для реакции, протекающей с участием n промежуточного  соединения, можно получить n характеристического времени. Исследование кинетики ферментативной реакции в предстационарном режиме позволяет получить представление о детальном механизме каталитического цикла и определить константы скорости элементарных стадий процесса.

     Экспериментально кинетику ферментативной реакции в предстационарном режиме исследуют с помощью метода остановленной струи, позволяющего смешивать компоненты реакции в течение 1 мс.