Генная инженерия

конкретный зонд представлял  копии одной молекулы ДНК с известной последовательностью нуклеотидов,  а данные по ДНК-гибридизации во всех лабораториях мира можно было сравнивать между собой.

Реакция гибридизации нуклеиновых  кислот –  чувствительный метод

выявления специфических  последовательностей нуклеотидов.  Гибридизация in situ – это отжиг одноцепочечного фрагмента ДНК на комплементарный ему участок другой молекулы ДНК с образованием двухцепочечной гибридной молекулы.  Отжиг –  процесс восстановления  (ренатурации) двухцепочечных молекул ДНК из одиночных полинуклеотидных цепей путем постепенного охлаждения.

Процедура поиска нужных генов  в банке получила название блоттинга (от англ. blotting – промокание). Блоттинг – это метод перенесения

электрофоретических фрагментов ДНК на специальную пленку (мембрану) из нитроцеллюлозы,  связывающую  (иммобилизующую)  одноцепочечные молекулы ДНК.  

6. Принципы клонирования генов в составе генетического вектора.

Клонирование – получение  большого количества копий определённого  гена в результате его размножения  в клетках в составе рекомбинантной ДНК.

Клонирование генов проводят с целью получения того или  иного

фрагмента ДНК в большом  количестве. Этот процесс необходим для получения многочисленных копий желаемых генов. Клонирование ДНК возможно благодаря способности бактериальных плазмид и фагов продолжать нормальное функционирование после встраивания в их геном чужеродной ДНК. Поскольку встроенные в геном чужеродные последовательности ДНК не влияют на свойства химерных штаммов бактерий, практически любая последовательность ДНК может быть клонирована таким образом. Для клонирования плазмиду, содержащую рекДНК, вводят в клетки бактерии (например, E. coli) или дрожжей, где происходит ее многократная репликация.Для клонирования небольших фрагментов ДНК используют плазмиды, фаговые ДНК, а для крупных – космиды и искусственные хромосомы. Клонирование рекомбинантных молекул с генами человека или животных в клетках бактерий дает возможность в условиях микробиологического синтеза получать большое количество нужных белков. Так, искусственно синтезированный человеческий ген инсулина введен в бактерию, что дало возможность получать человеческий инсулин (гормон, широко используемый в медицине при лечении сахарного диабета) в промышленных количествах.

Раньше для лечения  сахарного диабета использовали инсулин животного происхождения, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота. В 1979 г. из 60 млн больных диабетом во всем мире только 4 млн получали этот гормональный препарат. Однако, у 5 % возникали аллергические реакции, обусловленные антигенной несовместимостью гормона и клеток человека, т.е. такие больные были обречены на гибель. Кишечная палочка со встроенным геном инсулина синтезирует в культуре до 200 г инсулина на 1 л культурной среды, что эквивалентно количеству инсулина, выделенному из 1600 кг поджелудочной железы коровы или свиньи, и не вызывает аллергии. Природные штаммы бактерий инсулин никогда не продуцировали.

7. Генная терапия. Принципы и направления генной терапии.

Генная терапия - коррекция мутантных генов или нарушений клеточных функций с помощью методов генной инженерии. Генотерапия основана на введении нормальной копии гена в соматические клетки костного мозга, фибробласты кожи, миобласты, гепатоциты или лимфоциты пациента.

Основными направлениями  генотерапии является лечение моногенных наследственных и ненаследственных заболеваний.

Принципы генной терапии.

В зависимости от способа  введения экзогенных ДНК в геном  пациента генная терапия может проводиться  либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия (ex vivo) предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реинфузию их тому же пациенту. В настоящее время в большинстве допущенных к клиническим испытаниям программ генной терапии используются именно этот подход.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определённым образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний (муковисцидоз, рак лёгких).

Первый раз человека подвергли  такому лечению в США в 1990 г. Это  был четырехлетний ребенок, страдающий дефицитом редкого энзима, отсутствие которого разрушает иммунную систему  человека. Исправление или замещение  поврежденных генов производится по методам генной инженерии. Здоровый ген вводят в какой-нибудь вирус (обычно переносчик легко поддающейся  лечению инфекции) так, чтобы он был  непосредственно нацелен на поврежденные клетки. С самого начала генная терапия  была задумана как средство лечения  наследственных заболеваний - муковисцидиоз или серповидная анемия, но также исследовались возможности применения метода для лечения других болезней, таких как рак, при которой ген поражается только спустя некоторое время. Хотя тысячи больных уже были излечены, главным образом в США, генная терапия еще не сказала своего слова. Не все из вводимых генов достигают цели, и не все, попавшие в поврежденную клетку, эффективно срабатывают. Существует также проблема использования вируса в качестве переносчика гена. Организм встречает вирус как «чужака», и у некоторых пациентов из-за этого наблюдается тяжелая иммунная реакция. Существует и теоретический риск того, что сам вирус может распространиться и вызвать рак.

Генная терапия используется для лечения тяжелых состояний  иммунодефицита, когда исчезает ген, ответственный за выработку энзима аденозина дезаминазы (АДА). Так как АДА очень важен для выработки лейкоцитов (белых кровяных телец), это приводит к тому, что организм становится беззащитен против инфекций. Тогда два ретро-вируса (1) вводятся в костный мозг, который может выработать РНК из своего ДНК (2), используя резервный энзим транскриптазы (3). Потом эта ДНК объединяется с человеческими хромосомами (4). Когда количество хромосом увеличивается, вырабатывается новая вирусная РНК, вирусные протеины и АДА (5). Вирусная РНК и вирусные белки вырабатывают много новых вирусов, а АДА используется организмом для производства жизненно важных лейкоцитов. Потом процесс повторяется и распространяется на весь костный мозг.

8. Генная коррекция опухолевых заболеваний.

Одновременно с развитием  исследований в области генокоррекции наследственных дефектов успешными также оказались поиски терапевтического использования смысловых последовательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний, и главным образом злокачественных опухолей и вирусных инфекций.

В таблице приведены основные методологические подходы к генотерапии различных опухолей, разработанные и уже широко используемые. Многие из этих подходов вполне приложимы и для борьбы с наиболее серьёзными инфекционными заболеваниями, например, с ВИЧ-инфекцией.

Результаты первых клинических  испытаний этих подходов оказались  в высшей степени обнадёживающими, в особенности при лечении  нейродегенеративных и онкологических заболеваний нервной системы.

 

Таблица. Основные подходы  в генокоррекции онкологических заболеваний.

 

Принцип	Вводимые гены
Повышение иммунореактивности опухоли	Гены чужеродных антигенов, цитокинов
Генетическая модификация  иммунных клеток	Гены цитокинов, костимуляторов
Инсерция генов чувствительности либо «генов-самоубийц»	Гены тимидинкиназы HSV, цитозин дезаминазы
Блок экспрессии онкогенов	Антисмысловые Ki-ras мРНК, гены внутриклеточных антител
Инсерция генов-супрессоров опухолей	р53
Защита нормальных клеток от химиотерапии	Гены лекарственной устойчивости тип 1
Индукция синтеза противоопухолевых  веществ нормальными клетками	Гены интерлейкина 2, интнрферона
Продукция противоопухолевых  рекомбинантных вакцин	Вакцины типа БЦЖ, экспрессирующий опухолевый антиген
Локальная радиопротекция нормальных тканей с помощью антиоксидантов	Гены трансферазы, глутатион синтетазы

 

 

Таким образом, генетическая революция, апофеозом которой явилась  генная терапия, не только предлагает реальные пути лечения тяжелых наследственных и ненаследственных недугов, но и  в своём стремительном развитии ставит перед обществом новые  проблемы, решение которых настоятельно необходимо уже в ближайшем будущем.

 

Список литературы:

1. Баранов В.С. Соросовский образовательный журнал, №3, 1999.- с.63-67.
2. В.Н.Попрв, О.С.Машкина. Принципы и основные методы генетической инженерии. Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2009.- с.5-18
3. Горелов А.А. Концепции современного естествознания. – М.: Центр, 1997.
4. Научно-технический энциклопедический словарь (http://dic.academic.ru)
5. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии / В.Н. Рыбчин. – СПб. :Изд-во СПбГТУ, 1999. – 521с.
6. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. — М.: Мир, 1987. — Т. 1. — с.295
7. Глик Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применение /Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир, 2002. – 589 с.