Лабораторная диагностика инфекций передаваемых половым путем

Главными достоинствами реакции VDRL являются:

низкая стоимость, легкость постановки,

быстрое получение результатов с довольно высокой чувствительностью,

специфичностью, хотя и меньшей, чем в реакции с трепонемным антигеном.

Реакции иммунофлюоресценции

Все большее значение приобретают специфические серологические реакции РИФ и РИБТ.

Принцип РИФ основан на выявлении флюоресцирующих антител, так как меченные флюорохромом антитела не теряют способности соединяться с соответствующим антигеном и тем самым обусловливают свечение препаратов в сине-фиолетовых лучах, источником которых является ртутно-кварцевая лампа.

Отличительной чертой РИФ, по сравнению со стандартными серореакциями, является более высокая чувствительность (поэтому она бывает положительной у ряда больных в первичном серонегативном периоде сифилиса) при сохранении высокой специфичности. Однако, РИФ уступает по специфичности РИБТ, хотя по технике постановки она значительно проще.

Реакция ставится в нескольких модификациях: РИФ-ц, РИФ-200 и РИФ-абс. Считается, что РИФ-ц более чувствительна, а РИФ-200 и РИФ-абс – более специфичны.

Реакция ставится непрямым методом в 2 фазы. В первой фазе реакции на антиген наносится испытуемая сыворотка крови. Если в ней имеются соответствующие антитела, то образуется комплекс антиген – антитело. Для выявления образовавшегося комплекса проводится вторая фаза реакции, при которой его обрабатывают меченной флюорохромом иммунной кроличьей сывороткой (против сывороточных глобулинов человека)

Полученный во второй фазе комплекс антиген-антитело определяется с помощью люминесцентной микроскопии. Если свечения антигена нет, то это указывает на отсутствие в испытуемой сыворотке крови соответствующих антигену антител.

Наиболее ценной модификацией РИФ является РИФ-200, основным назначением которой считается не ранняя серодиагностика сифилиса, а распознавание неспецифических результатов КСР и серодиагностика других форм сифилитической инфекции, в том числе и скрытого сифилиса. При установлении излеченности сифилиса решающим является отрицательный результат РИФ-200. не обладает абсолютной специфичностью, поэтому вопрос о наличии или отсутствии заболевания должен решаться на основании совокупности клинических, серологических и других данных.

Техника постановки РИФ-200. Из антигена готовят препараты на тонких, обезжиренных предметных стеклах, на обратной стороне которых обозначены кружки диаметром 1 см. Антиген в пределах кружка, и высушенный на воздухе мазок фиксируют в течение 5 мин в чистом ацетоне. После фиксации стекла помещают во влажную камеру. Инактивированные испытуемые сыворотки крови разводят в 200 раз изотоническим раствором натрия хлорида. Для проведения первой фазы реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят испытуемые сыворотки. После этого влажную камеру закрывают и помещают в термостат при +35°С на 30 мин. По истечении этого времени препараты вынимают из влажной камеры, промывают в течение 10 мин в двух порциях изотонического раствора натрия хлорида и помешают в штатив для высушивания. После высушивания препараты вновь помещают во влажную камеру и наносят по капле разведенной по титру флюоресцирующей сыворотки против глобулинов человека. Вторую фазу реакции проводят при комнатной температуре, после чего препараты 10 мин промывают в изотоническом растворе натрия хлорида, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии. Монтирование препаратов заключается в том, что на них стеклянной палочкой наносят маленькие капли забуференного глицерина, накрывают их тонкими, обезжиренными предметными стеклами, на которые стеклянной палочкой наносят по капле нелюминесцирующее иммерсионное масло. Исследование препаратов производят в люминесцентном микроскопе. Степень свечения трепонем, зависящая от количества антител в сыворотке крови, обозначается плюсами. Свечение считается положительным, если его оценивают как 4+, 3+ и 2+.

Реакция иммунофлюоресценции-абсорбции с БТ (FTA ABS)

Используемый для реакции антиген представляет собой взвесь бледных трепонем из пораженных сифилисом яичек кролика, фиксированную ацетоном на предметном стекле. Можно также использовать лиофилизированные бледные трепонемы после их восстановления в изотоническом растворе натрия хлорида. Инактивированную сыворотку инкубируют с сорбентом для абсорбирования неспецифических групповых антител. Затем сыворотку помещают пипеткой на антиген, находящийся на предметном стекле. Специфические антитела связываются бледными трепонемами. После промывания к трепонемам на предметном стекле добавляют комплекс античеловеческого глобулина с флюоресцентным красителем. Этот комплекс связывается с человеческим глобулином на оболочке клеток бледных трепонем и может быть идентифицирован методом флюоресцентной микроскопии. По прошествии не менее 2 ч по степени флюоресценции сыворотку можно классифицировать как нереактоспособную, пограничную или реактоспособную. Реакция, обозначаемая двумя плюсами или больше, свидетельствует об инфекции.

Появления реактоспособности можно ожидать примерно в начале 3-й недели после заражения, а у нелеченных больных она обнаруживается постоянно. Сыворотка остается реактоспособной и через несколько лет после успешного лечения раннего сифлиса, а у больных, получивших адекватное лечение при позднем сифилисе, – на протяжении десятилетий.

Главными достоинствами реакции FTA ABS являются:

высокая специфичность и чувствительность,

быстро наступающая реактоспособность.

Положительная FTA ABS может иметь решающее значение для диагностики в сомнительных случаях, особенно при положительных реакциях VDRL или автоматизированной реакции микрогемагглютинации (АМНА ТР), используемых для скрининга.

Реакция 19S IgM-FTA-ABS

При идентификации антител IgM к бледным трепонемам реакцией FTA ABS с использованием конъюгата анти-IgM в качестве реагента выявлялись ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Реакция 19S IgM-FTA-ABS в этом отношении является наиболее точным, специфичным методом. В целях отделения крупных молекул 19S IgM от более мелких молекул 7S IgM используется методика ультрацентрифугирования, адсорбирования на белке А и гель-фильтрация с применением ультрагеля АсА 34 с трисбуфером при рН 8,0 на колонке К 26/100 при объеме геля 300 мл, скорости потока 27 мл/ч и +240С. В этой системе первый пик элюата содержит фракцию 19S IgM. В процессе фильтрования отделяются непрочные иммунные комплексы. Использование фракции 19S IgM в реакции FTA-ABS обеспечивает высокую специфичность, устраняя возможность неспецифических, ошибочных результатов.

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ)

Основное назначение – распознавание ложноположительных результатов при постановке стандартных серологических реакций. Это важно у больных с отсутствием клинических проявлений активного сифилиса или имеются поражения внутренних органов или нервной системы. Роль в распознавании ложноположительных результатов стандартных серологических реакций у беременных.

Сущность реакции заключается в потере подвижности бледными трепонемами в присутствии иммобилизинов испытуемой сыворотки и активного комплемента. Реакция ставится в условиях анаэробиоза.

Иммобилизины появляются в сыворотке крови больных позднее, чем другие антитела, и, следовательно, РИБТ становится положительной позже, чем стандартные серореакции и РИФ.

Оценка реакции:

при иммобилизации до 20% бледных трепонем реакция считается отрицательной;

при иммобилизации от 21 до 50% бледных трепонем – слабоположительной;

при иммобилизации от 51 до 100% – положительной.

Положительный результат РИБТ наблюдается у больных с тропическими трепонематозами (пинта, беджель). Иногда РИБТ дает ложноположительный результат при саркоидозе, эритематозе, туберкулезе, циррозе печени, атеросклерозе и др. С возрастом пациентов число ложноположительных результатов РИБТ увеличивается.

Упрощенная методика РИБТ. Пробирки с сыворотками расставляют в штативе. В журнале нечетными номерами отмечают все смесители, в которые добавлялся активный комплемент (опыт), и четными номерами – куда добавлялся инактивированный комплемент (контроль). Комплемент добавляют не для каждой сыворотки отдельно, а готовят «коктейль», т.е. предварительно соединяют комплемент с антигеном в нужных соотношениях для всех сывороток. Взвесь трепонем в питательной среде из расчета по 0,3 мл на каждую сыворотку делят на 2 части и добавляют в один флакон активный комплемент, а в другой - инактивированный.

В стерильный смеситель для лейкоцитов набирают сыворотку до метки 1. Конец смесителя стерильной ваткой вытирают от сыворотки, оставшейся на стенках. Т.к. при попадании положительной сыворотки в антиген в последующих сыворотках могут быть получены неверные результаты. Во избежание загрязнения при больших постановках разливают антиген параллельно в два флакона. После этого набирают взвесь трепонем с активным комплементом до метки 2. В другой смеситель набирают взвесь трепонем с инактивированным комплементом. Оба конца каждого смесителя закрывают резиновым кольцом, как для транспортировки крови, взятой для клинического исследования, и встряхивают для смешивания. Во избежание возможного влияния некоторых сортов резины места ее соприкосновения со смесителем следует смазывать вазелиновым маслом. Можно не закрывать концы смесителя резиновыми кольцами, а заливать их парафином с температурой плавления выше 50°С. Благодаря тому, что оба конца смесителя закрыты, прекращается доступ воздуха, взвесь трепонем находится в относительно анаэробных условиях.

Для контроля набирают в те же смесители все взвеси с активным и инактивированным комплементом, а также одну взвесь без комплемента. Ставят реакцию иммобилизации с сыворотками, заведомо отрицательными и заведомо положительными, оставшимися от прошлой постановки.

Заполненные и закрытые смесители помещают в специальный штатив. На каждый смеситель надевают нумерованные кольца из картона. Смесители помещают в термостат при +35°С на 18 20 ч. Для регистрации опыта через 18 ч смесители вынимают из термостата попарно - опыт и контроль.

Подсчет подвижных и неподвижных трепонем. По количеству смесителей в штативе расставляют и нумеруют пробирки. Содержимое смесителя выливают в соответствующую нумерованную пробирку, перемешивают тем же смесителем с надетой на него пипеткой и наносят каплю взвеси с активным комплементом на левую сторону предметного стекла, а на правую сторону – с инактивированным комплементом той же сыворотки; посредине стекла ставят номер сыворотки. Капли накрывают покровными стеклами. Капли должны быть небольшими, иначе трепонемы «плывут» с током жидкости, и тогда суждение об их подвижности и подсчет затруднительны. Учет результатов реакции начинают с инактивированного комплемента. Подсчитывают 25 - 30 трепонем и отмечают, какое количество среди них подвижных и какое – неподвижных. Если в контроле содержится меньше 17 подвижных трепонем из 25 сосчитанных, то такой опыт непригоден и его следует повторить. В пробирках с инактивированным комплементом отсутствие подвижности трепонем объясняется не иммобилизацией, а токсичностью сыворотки или недостаточно высоким качеством среды сохранения.

При определении подвижности трепонем следует учесть, что движения трепонем различны. Они могут обладать весьма активной подвижностью, особенно отчетливы сгибательные движения, а иногда отмечаются только винтовые движения. Иногда трепонема лежит как бы неподвижно, но если присмотреться, то видно, что через некоторое время она начинает активно двигаться. Следует также уметь отличать активные движения трепонемы от движения с током жидкости.

В пробирках, в которые вылили содержимое смесителей, в дальнейшем определяют остаточный комплемент (во всех пробирках опыта и контроля). Пробирки с инактивированным комплементом служат как бы контролем для сравнения происшедшего гемолиза.

Расчет специфической иммобилизации производят по следующей формуле:

(Число подвижных трепонем в  контроле – число подвижных  трепонем в опыте) / Число подвижных  трепонем в контроле * 100.

Реакция иммобилизации считается положительной, когда % иммобилизации выше 51; от 31 до 50% – слабоположительной; сомнительной – от 21 до 30% и отрицательной – ниже 20%.

Опыт с сомнительными, а иногда и слабоположительными результатами следует повторить; при этом можно получить или положительный, или отрицательный результат. Неудовлетворительным считается результат, если имеется большое бактериальное загрязнение или отмечается токсичность сыворотки. Такие исследования следует повторить с новой порцией сыворотки. Целесообразно также подвергать повторному исследованию все сыворотки, давшие полное расхождение со стандартными серологическими реакциями. Эти сыворотки заслуживают особого внимания, так как в таких случаях результаты РИБТ могут дать опору для суждения о наличии или отсутствии сифилиса.

При постановке опыта обращают внимание на соблюдение стерильности и чистоты посуды. Она должна быть свободна от примеси веществ, могущих оказать вредное влияние на жизнеспособность трепонем. Смесители и всю посуду моют сначала холодной водой, затем горячей, споласкивают дистиллированной водой, не применяя никаких дезинфицирующих средств. Смесители стерилизуют в автоклаве, подсушивают в сушильном шкафу.

Реакция иммунного прилипания бледных трепонем (РИП)

Основана на том, что вирулентные тканевые трепонемы, сенсибилизированные сывороткой больного сифилисом, в присутствии комплемента и эритроцитов прилипают к поверхности эритроцитов и при центрифугировании увлекаются с ними в осадок, исчезая из надосадочной жидкости.

Для постановки реакции используются: испытуемая сыворотка, антиген, комплемент, эритроциты донора, изотонический раствор натрия хлорида. Кровь берут из вены и обрабатывают, как для реакции Вассермана. Сыворотку крови инактивируют в водяной бане при +55 56°С в течение 30 мин. В качестве антигена используют взвесь бледных трепонем штамма Никольса.

Техника постановки. Предварительно для реакции разводят все ингредиенты. На дно центрифужной пробирки микропипеткой наливают 0,05 мл испытуемой сыворотки, добавляют 0,35 мл смеси комплемента (0,05 мл) с антигеном (0,3 мл). Пробирки энергично встряхивают в течение 30 сек. и оставляют при комнатной температуре на 30 мин; затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл взвеси эритроцитов, пробирки энергично встряхивают в течение 30 сек. и оставляют в термостате при +37°С на 30 мин, после чего все пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3 мин.

Учет результатов проводят путем подсчета бледных трепонем в надосадочной жидкости. Для этого 0,01 мл надосадочной жидкости микропипеткой наносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и в темном поле зрения подсчитывают число бледных трепонем в 10 полях зрения. При просмотре препарата под микроскопом учитываются только те бледные трепонемы, которые могут свободно перемещаться с током жидкости. Те же трепонемы, которые попали в поле зрения с током жидкости дополнительно, после начала подсчета («приплывшие»), в этом поле зрения уже не учитываются. Процент прилипания бледных трепонем исчисляется по формуле:

 

(100 – Оn) /K * 100,

 

где On – число бледных трепонем в 10 полях зрения из опытной пробирки;

К – число бледных трепонем в 10 полях зрения из контрольной пробирки.

При иммунном прилипании бледных трепонем, равном 0 - 20%, результат расценивается как отрицательный; 21 - 30% - сомнительный; 31 - 50% - слабоположительный и при 51 - 100% - положительный.

В ответе результат реакции выписывается без указания процента. В случае несовпадения результатов РИП с данными других реакций необходимо провести повторный учет результатов РИП с вновь приготовленным препаратом, повторить постановку реакции с этой же сывороткой крови, при необходимости повторить РИП с сывороткой крови, взятой у обследуемого повторно.