Методика определения и показатели устойчивости бактерий к дезинфеткантам

Для испытания  на устойчивость используют чистые культуры бактерий, выделенные с помощью стандартных  методик. Испытание проводят не позже 1-2 дней после выделения. Перед испытанием культуры засевают на скошенный питательный агар, выращивают в термостате при 37° С в течение 16-20 ч, смывают 0,9% раствором хлорида натри с 20% лошадиной сыворотки, стандартизируют плотность" в 2-109 бактерий/мл. Культуры испытывают раздельно; при массовых исследованиях допустимо объединение нескольких культур из одного объекта.

Поскольку подавляющее  большинство дезинфектантов применяют  в виде водных растворов, функциональные свойства которых определяются концентрацией  присутствующего в них активно  действующего начала, объективной характеристикой чувствительности к препарату служит концентрация дезинфектанта, вызывающая гибель 100% внесенных бактерий в фиксированное время. Такой подход в отличие от использования различных временных интервалов при фиксированной концентрации, кроме того, обеспечивая большую возможность количественной оценки и более привычен для практических бактериологов.

Дезинфектанты разводят стерильной теплой водой в асептических условиях в концентрациях, зависящих от используемых показателей.

По описанной в п. 1.3 методике готовят взвеси испытуемых культур.

Взвесями бактерий контаминируют  штифты штампа - репликатора (одновременно в одном репликаторе может  быть испытано 50 культур, а в случае смешанных культур - в несколько  сколько раз больше). Для этого  в лунки основания репликатора пастеровской пипеткой вносят взвеси испытуемых культур до образования вогнутого мениска (2-3 каш штифты крышки репликатора опускают в лунки, содержал взвеси бактерий, глубина погружения штифтов должна составлять 2-3 мм; спустя 5 мин крышку с штифтами снимают с лунок и помещают на опорное кольцо для высушивания бактериальной взвеси. Высушивают в асептических условиях на воздухе при комнатной температуре в затемненном месте.

Дезинфекцию штифтов проводят в лунках репликатора, в которые предварительно пипеткой вносят заданный раствор дезинфектанта. После этого в лунки с дезинфектантом осторожно опускают контаминированные бактериями штифты. Глубина погружения должна соответствовать примерно 4-5 мм, что контролируется ограничителем штифта.

После 10-минутной экспозиции в дезинфектанте штифты переносят  в лунки штампа-репликатора, заполненные  нейтрализатором, и выдерживают  в нем 10 мин. Глубина погружения штифтов  должна быть больше, чем уровень  погружения штифтов в дезинфектант, что также обеспечивается ограничителем. Для нейтрализации хлорамина, диконита, перекиси водорода, препаратов йода используют 1% раствор тиосульфита натрия (гипосульфита хлоргексидина-0,6% раствор сульфонола, формалина- 1% раствор сульфита натрия, фенола и его препаратов-3% твин-80 (полисорбат) с 0,3% лецитина (или 1,5% эмулз куриного желтка).

В контроле роста бактериальных  культур контаминированные описанным  выше способом штифты погружают на 20 минут в лунки со стерильной водой, в контроле нейтрализатора контаминированные штифты екают на 10 мин в раствор нейтрализатора.

После истечения экспозиции опытные и контрольные репликаторы  извлекают из нейтрализатора (воды) и концевые площадки штифтов репликаторов на 5 с слегка прижимают к поверхности  АГВ или другой питательной среды на бактериологических чашках. На дне чашки чертой обозначают верх, который при посеве-реплике должен совпадать с чертой на крышке репликатора. Посевы выдерживают в термостате 37° С в течение 48 ч, после чего на фоне бумажного эталона с номерами культур учитывают наличие или отсутствие роста бактерий в зонах посевов-отпечатков. Культуру считают устойчивой ко взятой в опыт концентрации дезинфектанта, если в зоне отпечатка опытной чашки вырастает хотя бы одна колония при условии сплошного роста на отпечатках контролей. Для повышения достоверности каждой испытуемой культурой (или ее субкультурами) следует контаминировать 3 штифта или проводить исследование 3-кратно. 

2.1.2 Сравнительная  оценка предлагаемой и референтной  методик

Определены  правильность и воспроизводимость предлагаемой и референтной методик (ГОСТ 16263-70). В качестве референтной взята широко применяемая в России методика батистовых тест-объектов ВНИИДиС.

Правильность оценивали  путем сравнения результатов 10-ратного  определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) хлорамина Б для 5 штаммов S. aureus с помощью предлагаемой и референтной методик. X ±SX МБК хлорамина в предлагаемой методике равнялась (в г/100 мл): у039±0,04, 0,085+0,016, 0,089 ±0,011, 0,107 ±0,033, 1,074 + 0,011, в референтной соответственно: 0,038 ±0,05, 1,098±0,022, 0,116±0,024, 0,098 ±0,018, 0,106 + 0,021. Показатель рмежду сравниваемыми методиками во всех случаях был меньше 0,05, (-колебался от 0,16 до 1,33. Следовательно, различия между результатами предлагаемой и референтной методик недостоверны, что является показателем правильности первой.

Воспроизводимость (в серии  и во времени) оценивали путем  сравнения результатов 10-кратного испытания  чувствительности 25 штаммов S. aureus к  хлорамину с установлением ДБК  в ряде. Мерилом разброса результатов вокруг средней арифметической служили среднеквадратическое отклонение (о) и коэффициент вариации (К). Как видно из таблицы, разброс результатов в обоих методиках относительно высок, что, вероятно, является как результатом гетерогенности популяции стафилококка по признаку чувствительности к дезинфектанту, так и следствием совершенства методик. Воспроизводимость предлагаемой методики по сравнению с референтной оказалась более высокой.

Для сравнения экономичности  проведен хронометраж, который показал, что предлагаемая методика в течение 7 ч позволяет определить МБК 3 дезинфектантов у 50 культур затратой 510 мл питательной среды. Для того чтобы такой объем работы выполнить методикой батистовых тест-объектов требуется 102 ч и 15 500 мл питательной среды. Следовательно, предлагаемая методика дает экономию времени в 14,6 раза, питательных сред - 30,4 раза. Преимущество предлагаемой методики перед референтной также состоит в большей дискретности показателей и привычности постановки и оценки, поскольку близкий подход используется при определении чувствительности к антибиотикам и антисептикам.  

2.1.3 Показатели  чувствительности (устойчивости) бактерий  к дезинфектантам

Практическое  здравоохранение не имеет не только унифицированных методов испытания чувствительности культур такого типа бактерий к дезинфектантам, но и общепринятых показателей оценки этого явления. В том классе методик, которому относится предлагаемая нами, оценка активности препарата или чувствительности бактерий проводится по МБК при стабильной экспозиции или по минимальной экспозиции при стабильной концентрации препарата, причем как стандартная концентрация, так и стандартная экспозиция не унифицированы.

На выборках больничных и  внебольничных штаммов энтеробактерий, псевдомонад и стафилококков кроме МБК испытан комплекс показателей, предложенный ранее для оценки чувствительности бактерий к антисептикам. Опираясь на полученные при этом результаты, мы рекомендуем для практических целей следующие показатели:

Для получения МБК испытывают ряд разведений дезинфектанта, минимальная концентрация которого не оказывает бактерицидного действия ни на один штамм, а максимальная - подавляет все штаммы. За МБК принимается минимальная концентрация дезинфектанта (в граммах на 100 мл), которая вызывает гибель всех присутствующих в стандартизованной дозе бактерий за 10-минутную экспозицию. Если МБК равна или выше рабочей концентрации дезинфектанта, культура оценивается как устойчивая, если меньше - как чувствительная. Методика определения МБК требует затраты большого количества времени, дезинфектантов и сред, поэтому в практических целях может применяться в особых случаях [2].

2. Показатель  клинической устойчивости. В качестве дифференцирующей (клинически устойчивые и клинически чувствительные культуры) взята рабочая концентрация (рекомендуемая для практической дезинфекции) препарата. Культуры, погибающие при 10-минутном воздействии такой концентрации (не растущие при посеве на питательные среды), относят к клинически чувствительным; культуры, которые остаются живыми (дают рост на средах) - к клинически устойчивым. Поскольку в практике дезинфекции, как правило, не учитывают различия в уровнях видовой чувствительности, дифференцирующие уровни при определении клинической устойчивости одинаковы по отношению ко всем видам бактерий, но различны для каждого дезинфицирующего препарата. В тех случаях, когда на практике рекомендуется использовать несколько концентраций, например в зависимости от требуемой степени дезинфекции, мы рекомендуем определять устойчивость выделенных из биотопа культур к рекомендуемой для него концентрации дезинфектанта.

Лучшие результаты при определении клинической  устойчивости дала бы ориентация не на вносимую на объект концентрацию, а на концентрацию, которая создается после внесения дезинфектанта. Однако такой подход пока не реален. Показатель клинической устойчивости дает врачу необходимую для эффективной дезинфекции информацию и в то же время доступен бактериологическим лабораториям больниц и санэпидстанций. Поэтому мы рекомендуем его в качестве основного.

3. Показатель  биологической (статистической) устойчивости. Клиническая устойчивость отражает  высокий уровень устойчивости. Однако  в случаях постепенного нарастания признака устойчивости в популяциях бактерий, как показали наши исследования, часто обнаруживаются культуры, которые относятся к клинически чувствительным, но с биологических позиций не могут быть признаны таковыми, поскольку выходят из статистического ряда чувствительных культур. Это наблюдение позволило нам ввести показатель биологической устойчивости к дезинфектантам, дифференцирующей концентрацией которого является средняя величина МБК с двумя квадратическими отклонениями (Х±2о) для выборки в 100 культур из биотопа, в который не вносился дезинфектант. Ценность этого показателя состоит в том, что он дает более раннюю и полную информацию о сдвигах в чувствительности популяции к дезинфектантам, иногда еще до появления клинически устойчивых культур. Это позволяет изменить режим дезинфекции на более раннем этапе. Концентрации дезинфектантов, дифференцирующие биологически чувствительные и устойчивые культуры, специфичны для каждого дезинфектанта и для каждого вида бактерий. Их находят опытным путем.

4. Индекс активности дезинфектанта (ИАД). Показатель клинической устойчивости дает качественную оценку чувствительности культуры (чувствительная, устойчивая) или дезинфектанта (активен, неактивен), что затрудняет выбор более активного дезинфектанта. Количественную оценку можно сделать с помощью предлагаемого нами ИАД, который представляет собой отношение рабочей концентрации дезинфектанта к его МБК для конкретной культуры или Х±2а для популяции, вида или группы близкородственных по признаку чувствительности видов бактерий. Чем выше эта величина, тем более чувствительна культура или активен дезинфектант. Показатель ниже единицы указывает на устойчивость культуры или неэффективность дезинфектанта.

Для исследовательских  целей ценная дополнительная информация о чувствительности (устойчивости) бактерий к дезинфектантам может быть получена при построении графика распределения индивидуальных МБК в системе абсцисса- ордината, расчете амплитуды индивидуальных МБК, определении частоты, уровней и спектров устойчивости.

Описанная в статье методика и показатели с положительными результатами опробованы на выборках из больничных и внебольничных популяций стафилококков, псевдомонад и энтеробактерий, что позволяет рекомендовать их для использования в практической медицине и Научных исследованиях.  

2.2 Методика, основанная на применении цветной  питательной среды, больших доз  бактерий и пластмассовых пластин  с луночками

Применение  цветной питательной среды, больших  доз бактерий и пластмассовых  пластин с луночками является основой ускоренного и упрощенного способа определения антибактериальной активности дезинфекционных средств. Учет результатов испытания активности дезинфекционных средств опирается на регистрацию изменения цвета питательной среды после термостатирования смесей раствора дезинфекционного средства и взвеси бактерий, а также на учете мутности в лунках пластины.

Разработанная методика позволяет не только оценивать  антибактериальную активность большинства  дезинфекционных средств, но и определять устойчивость бактериальных культур (в том числе госпитальных) к дезинфекционным средствам.

В последние  годы стали появляться сообщения, в  которых приведены факты появления  устойчивости бактериальных культур  к дезинфекционным средствам. Авторы этих работ убеждены, что устойчивость бактерий к дезинфектантам широко распространена среди госпитальных штаммов, в связи с чем необходим мониторинг этого явления. Но в этом случае следует обладать методиками, которые позволили бы изучать выделенные в ЛПУ и других объектах штаммы в широком ассортименте, в то время как существующие методы громоздки и трудоемки.

Для определения  антибактериальной активности дезинфекционных  средств последние титровали  в плоскодонных луночках стерильных пластинок типа Titerteck, предназначенных  изначально для иммуноферментного анализа. Разведения дезинфекционных средств, как и приготовление взвеси бактериальных культур осуществляли с помощью цветной питательной среды. Учет результатов вели после термостатирования при 37°С по изменению исходного цвета питательной среды и появлению мутности, которые регистрировали визуально, но возможен учет инструментальный в аппарате типа Multiscan при использовании фильтра 450 nm.

Методика основана на хорошо известном факте, что по мере роста в цветной питательной  среде бактерии сдвигают рН в кислую сторону, что влечет за собой изменение цвета среды, а эффективное дезинфекционное средство, по нашему предположению, должно предотвращать конверсию цвета. Работу начали с испытания роста некоторых эталонных штаммов бактерий в питательных средах, в состав которых входили разные индикаторы - феноловый красный, бромкрезолпурпур или бромтимоловый синий. Наиболее яркий переход от исходного цвета к желтому получили при использовании питательной среды с бромкрезол-пурпуром, но наиболее чувствительной к конверсии цвета оказалась зеленая питательная среда с бромтимоловым синим.