Методы медицинской генетики

В 1959 г. французские ученые Д. Лежен, Р.Тюрпен и М. Готье установили хромосомную природу болезни Дауна. В последующие годы были описаны многие другие хромосомные синдромы, часто встречающиеся у человека. Цитогенетика стала важнейшим разделом практической медицины. В настоящее время цитогенетический метод применяется для диагностики хромосомных болезней, составления генетических карт хромосом, изучения мутационного процесса и других проблем генетики человека¹⁵.

В 1960 г. в г. Денвере (США) была разработана первая Международная  классификация хромосом человека. В  ее основу легли размеры хромосом и положение первичной перетяжки — центромеры.

Применение  цитогенетического  метода  в  клинической  генетике  обусловило  развитие нового направления - клинической цитогенетики, которая позволяет:

-  установить  происхождение   структурно  перестроенных  хромосом  и  их  точную классификацию;

-  выделить  синдромы,  обусловленные  дисбалансом  по  участкам  индивидуальных хромосом;

-  накапливать  сведения  об  изменениях  хромосом  в   опухолевых  клетках,  у  больных  с наследственными заболеваниями крови  и т.д.

Метод позволяет идентифицировать кариотип (особенность строения и число хромосом), путем  записи  кариограммы.  Цитогенетическое  исследование  проводится  у  пробанда,  его родителей,  родственников  или  плода  при  подозрении  на  хромосомный  синдром  либо  другое хромосомное нарушение.

Объектом  исследования  служат  культуры  лимфоцитов  периферической  крови, фибробластов кожи, клеток других тканей.

С  помощью  метода  определяется  наличие  Х  и  У  полового  хроматина,  определяющего истинную  половую  принадлежность.  Половой  хроматин (тельце  Барра) -  в виде  компактной  глыбки   в ядрах соматических  клеток  имеется только  у женщин.  Он   определяется   в эпителиальных  клетках  ротовой  полости,  вагинальном  эпителии  и   клетках  волосяной луковицы.

Показания для цитогенетического  обследования больного¹⁶:

1)  множественные  пороки  развития (с  вовлечением  трех  и более систем);  наиболее постоянные   нарушения -  пороки   развития   головного мозга,  опорно-двигательной  системы, сердца и мочеполовой системы;

2) умственная отсталость  в сочетании с нарушениями  физического развития, дисплазиями, гипогенитализмом;

3)  стойкое  первичное   бесплодие   у   мужчин   и   у   женщин   при исключении гинекологической и урологической патологии;        

4) привычное невынашивание беременности, особенно на ранних стадиях;        

5) нарушение полового  развития (гипогонадизм, половые инверсии);

6) небольшая масса ребенка,  рожденного при доношенной беременности.

Для  проведения  исследования достаточно  получить  образец  периферической  крови  пациента  объемом  1-2 мл. Анализ   кариотипа проводят в три этапа: культивирование лимфоцитов крови, окраска препарата и его микроскопический анализ. Культивирование проводят для того, чтобы стимулировать деление лимфоцитов, так как успех цитогенетического исследования  зависит от количества клеток, находящихся на  стадии  метафазы,  когда  хромосомы  находятся  в  наиболее  компактной форме. Световое микроскопирование окрашенных препаратов является самым трудоемким  этапом  всего исследования,  требующим высокой квалификации.  Для выявления хромосомных  аномалий  необходимо проанализировать  не  менее  30  метафазных  пластинок¹⁷. 

Большой эффективностью обладают методы компьютерного анализа хромосом. 

Разработаны также методы окрашивания  хромосом  в  клетках,  находящихся  в  состоянии  покоя,  когда хромосомы  максимально  растянуты.  С их  помощью могут быть идентифицированы сегменты хромосом размером около  50 килобаз. 

Таким образом, цитогенетический  метод  применяется  для  анализа  кариотипа    и  его аномалий  у  отдельных  индивидуумов. 

 

 

6. Молекулярно-генетические и молекулярно-биологические методы

 

Это  большая  и  разнообразная  группа  методов  исследования  молекулярной  структуры ДНК, основные дифференциально-диагностические тесты, необходимость разработки которых обусловлена  генетической  природой  наследственных  заболеваний,  их  выраженным клиническим полиморфизмом, а также существованием генокопий и фенокопий.

Особое  место  в  этой  группе  занимают   методы  ДНК-диагностики (зондовой).  Они позволяют  диагностировать  заболевание  на  уровне  первичного  молекулярного  дефекта - патологического  гена.  Ее  точность  в  установлении  причины  наследственного  дефекта абсолютна.

Внедрению  молекулярно-генетической  методологии  в  клиническую

практику  способствовала  разработка  метода  полимеразной  цепной  реакции (ПЦР) или специфической  амплификации ДНК, произошедшая более 20 лет назад¹⁸. Первооткрыватель этого метода Керри Мулис за свое изобретение был удостоен  Нобелевской премии  в 1993  году.  Метод  ПЦР    позволяет тестировать  состояния  генов  у  отдельных  индивидуумов.  Его  суть заключается  в  избирательном  копировании  in  vitro  небольшого  фрагмента гена,  в котором предположительно  может быть  локализована  мутация,  с использованием  в качестве  матрицы геномной  ДНК обследуемого.

Небольшие размеры копируемого (или амплифицируемого) фрагмента гена в сочетании  с  их  огромным  числом  позволяют  в  дальнейшем  использовать очень  простые  методы  для  анализа  этого  участка  ДНК,  выявления  его особенностей у обследуемого пациента. Главными из этих методов являются электрофорез  амплифицированной  ДНК,  ее  окрашивание,  разрезание специфическими  ферментами  – рестриктазами,  и определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента - секвенирование. 

ПЦР  лежит  в  основе  ДНК-диагностики  любых  наследственных заболеваний.  Данный  подход  широко используется  и для анализа генетических  факторов  риска,  предрасполагающих  к  развитию  широко распространенных  мультифакториальных  заболеваний.  В случае молекулярной  диагностики  инфекций  амплифицируется  фрагмент  ДНК, специфичный для определенного возбудителя,  а  затем  с  помощью электрофореза и окрашивания на ДНК тестируется наличие этого фрагмента,

а значит и самого возбудителя, в том биологическом образце, который был 

взят  для анализа.  Использование ПЦР в судебной  медицине  основано  на 

амплификации  высоко  изменчивых  областей  генома,  позволяющих проводить идентификацию личности – метод геномной дактилоскопии¹⁹. 

Преимуществом ДНК-диагностики  по сравнению с биохимической или

иммунологической диагностикой является использование унифицированного

набора  методов,  практически  не  зависящего  от  целей  проводимого 

исследования. Это методы выделения ДНК, ПЦР, электрофорез, рестрикция

ДНК,  гибридизация  со  специфическими  ДНК-зондами  и  секвенирование. Таким образом,  в пределах  одной лаборатории можно заниматься  ДНК-

диагностикой  широкого  спектра  заболеваний.

Среди основных методов ДНК-диагностики  выделяются:

- дозовый блот-гибридизационный анализ;

- анализ полиморфизма  длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ);

- полимеразная цепная  реакция (ПЦР);

- анализ полиморфизма  микросателлитных последовательностей.

Благодаря  этим  методам  у  врачей  появились  уникальные  возможности  эффективного применения в различных областях медицины самых совершенных технологий.

В  настоящее  время  в  ДНК-диагностике  выделяют 4  подхода.  Они  применяются  в  зависимости от того: известен или  не известен ген данного заболевания, клонирован или нет этот  ген или ДНК-копия его тРНК  или кодирующей  ДНК,  известна  или нет природа мутации,  вызывающей  заболевание,  насколько широко  распространена  данная мутация   в различных случаях данного заболевания в данной популяции, данном географическом регионе

Виды  ДНК-диагностики:  подтверждающая,  пресимптоматическая,  носительства, пренатальная²⁰.  Принципиально различают прямую  и косвенную диагностику моногенных наследственных болезней.  Прямые  методы возможны лишь при условии, что ген заболевания клонирован, известна  его экзон-интронная организация или нуклеотидная последовательность полноразмерной комплементарной ДНК. При прямой диагностике предметом анализа являются мутации гена.  Главным преимуществом прямых  методов диагностики является  почти 100%  эффективность. Прямые методы основаны на технологии ПЦР.

Однако  в  большинстве  случаев  наследственных  заболеваний  ген  не  клонирован  или заболевание  является  генетически  гетерогенным,  т.е.  обусловлено  повреждением  в  разных генах,  либо  молекулярная  организация  гена  не  позволяет  использовать  прямые  гены.  Эти трудности  могут  быть  преодолены  с  помощью   косвенных   методов   ДНК-диагностики, основанных  на  использовании  сцепленных  с  геном  полиморфных  маркеров.  В  этом  случае определяется  гаплотип  хромосомы,  несущей мутантный ген в семьях  высокого  риска,  т.е.  у родителей больного и его ближайших родственников. Такой подход возможен практически для всех моногенных заболеваний с известной локализацией гена. Основной недостаток косвенных методов  диагностики -  обязательное  предварительное  изучение  генотипа (гаплотипа)  хотя  бы

одного  пораженного  родственника.  В  случае  отсутствия  пораженных  родственников, доступных для обследования, проведение диагностики (за редким исключением) становится невозможным.

Таким образом,  молекулярная  диагностика является  наиболее  объективным  методом  верификации  наследственных заболеваний. Важно подчеркнуть, что нахождение мутаций в гомозиготном или  гетерозиготном  состояниях  соответственно  при  рецессивных  или доминантных заболеваниях является бесспорным подтверждением диагноза.

 

7. Биохимические методы

 

Эти  методы  помогают  обнаружить  целый  ряд   заболеваний   с нарушениями обмена веществ (энзимопатии). Исследованию подлежат кровь, моча, ликвор, пунктаты костного мозга, амниотическая жидкость, сперма, пот, волосы, ногти, кал и др.

На  первом  этапе  обследования  (экспресс-диагностика)  применяются методы массового биохимического скрининга: пробы Феллинга (на фенилкетонурию), Альтгаузена (гликогенозы), Бенедикта (галактоземия, фруктоземия),  проба на  гипераминоацидурию, микробиологический тест Гатри (ФКУ и др. аминоацидопатии). Разработаны простые качественные биохимические тесты для эксперсс-диагностики гипотиреоза,  муковисцидоза,  для выявления нарушений обмена  билирубина,  болезни Тея-Сакса,  гепатолентикулярной дегенерации,  АГС.  Эти пробы достаточно просты и используют легко доступный биологический материал (кровь, моча)²¹.

На втором этапе (уточняющая диагностика) применяют молекулярно-цитогенетические, молекулярно-биологические методы, более сложные методы аналитической биохимии:

-  исследование  метаболического   пути (количественное  определение метаболитов,  их кинетики и накопления);  

-  прямое  измерение   концентрации (иммунохимические  методы),  активности (энзимодиагностика), физико-химических и кинетических параметров мутантных белков;

- исследование мутантных  белков с помощью нагрузочных проб мечеными субстратами и гибридизации соматических клеток;

- исследование структуры  мутантного гена методами рестрикционного анализа.

Большие перспективы открываются  с применением жидкостной и газовой хроматографии, позволяющей  определить  аминокислотный  состав  исследуемого  субстрата  в  течение нескольких минут.

Показания для биохимического исследования²²:

1) умственная отсталость, психические нарушения; 

2)  нарушение  физического   развития -  аномальный  рост  и  строение  волос или ногтей; неправильный  рост  с искривлением  костей  туловища  и  конечностей,  чрезмерное   отложение жира, гипотрофия или кахексия, тугоподвижность или разболтанность суставов;

3) плохое зрение или  полная слепота, тугоухость или  глухота; 

4)  судороги,  мышечная  гипотония,  гипер-  и гипопигментация,  фото-чувствительность, желтуха;

5)  непереносимость   отдельных  пищевых  продуктов  и лекарственных препаратов, нарушение пищеварения, частая рвота, диарея, жидкий  стул, гепато- и спленомегалия;

6) почечно-каменная болезнь, холестаз;

7) гемолитические  анемии  и др. состояния. 

Некоторые  методы  позволяют  одновременно  проводить  количественную оценку  нескольких  тысяч  метаболических  маркеров.  Однако  эти  методы требуют  использования  достаточно  дорогого  оборудования  и  расходных материалов.   В  некоторых  случаях  иммунологические  методы  анализа  белков оказываются более эффективными по сравнению с биохимическими. Среди них следует упомянуть иммуногистохимический  метод,  позволяющий проводить анализ  белков  и определять  их  локализацию  в специализированных  клетках  и  тканях  организма. 

 

8. Иммунологические методы

 

Иммунологические методы  применяют  при  обследовании  больных  с  иммунодефицитными состояниями (агаммаглобулинемия,  атаксия-телеангиэктазия-синдром Луи-Бар   и др.), при подозрении на антигенную несовместимость крови матери и плода, при установлении отцовства²³.