Молекулярная патология гемоглобина. Серповидноклеточная анемия

Повышенное сродство к кислороду приводит к уменьшению количества кислорода, освобождающегося из комплекса с гемом в тканях организма, и вызывает гипоксию. Гипоксия ведет к выделению гормона эритропоэтина, стимулирующего образование эритроцитов и собственно эритроцитоз.

Было обнаружено всего три гемоглобина с уменьшенным сродством к кислороду. При таком дефекте количество кислорода, поступающее в ткани, увеличивается, поэтому следует ожидать уменьшение синтеза эритропоэтина. В двух случаях, как и следовало ожидать, наблюдалась слабовыраженная анемия.

Кроме вариантов гемоглобина, обусловленных единичными аминокислотными заменами, есть и гемоглобины возникшие вследствие делеций и дупликаций.

Делеции. Делеции генов Нbα приводят к возникновению α-талассемий. Делеции могут затрагивать один или несколько кодонов, но возможно выпадение и одного, двух нуклеотидов.

Если делеция затрагивает один кодон (триплет нуклеотидов), то это приводит к выпадению из глобиновой цепи соответствующей аминокислоты. Были обнаружены делеции 15 нуклеотидов, что приводило к выпадению 5 аминокислот. Скорее всего, делеции большего объема приводили бы к потере функциональной активности молекулой гемоглобина. Большинство делеционных гемоглобинов либо нестабильны, либо приводят к увеличению сродства к кислороду, а во многих случаях имеют оба эти свойства.

Если число делетированных нуклеотидов не кратно трем, то смысл считываемой генетической информации полностью меняется и в результате возникает новая последовательность аминокислот. То есть возникает мутация сдвига рамки считывания. После анализа мутации «гемоглобин Wayne» оказалось, что она обусловлена делецией одного нуклеотида в 139-м кодоне вблизи конца гена α-глобина, состоящего из 141 триплета. Нуклеотиды 142-го терминирующего кодона считываются по-другому, и новая рамка считывания продолжается до первого в этой рамке терминирующего кодона. Таким образом, формируется слегка удлиненная цепь молекулы гемоглобина, содержащая 5 дополнительных аминокислотных остатков. Совершенно естественно, что делеция локализуется вблизи конца α-цепи, так как любая делеция, вызывающая сдвиг рамки считывания на протяженном участке структурного гена, будет приводить к синтезу функционально неактивных полипептидов.

По-видимому, возникновение делеций является следствием ошибочного спаривания между гомологичными последовательностями во время мейотического деления развивающихся генеративных клеток. При рассмотрении нуклеотидных последовательностей, окружающих области делеций у различных делеционных мутантов, обнаруживаются участки гомологии, которые могут быть причиной неправильного спаривания. Если оно произошло, последующие рекомбинационные события приведут к возникновению делеций различной протяженности.

Результатом неправильного спаривания может быть и образование комбинированных (составных) генов. Белковые продукты таких генов состоят из N-концевой части одного глобина и С-концевой части другого. В качестве примера можно привести гемоглобин Lepore. Его синтез контролируется комбинированным геном Hbδ-β. Известно несколько таких генов, возникающих при кроссинговере в разных точках. Они различаются по относительной длине последовательностей δ- и β-генов, входящих в их состав. Гемоглобин Kenya возникает в результате ошибочного спаривания генов HbAγ и Hbβ и последующего кроссинговера. Его хромосома содержит только ген HbGγ и комбинированный ген HbAγ-β.

Дупликации. Дупликации могут охватывать целые гены. Именно это происходило в ходе эволюции различных цепей глобина. На более поздних этапах при внутрихромосомных дупликациях появились два гена α-глобина и два гена γ-глобина. Известны и внутригенные дупликации. Например, при мутации «гемоглобин Grady» в α-цепи глобина дуплицированы остатки 116-118.

Дупликации одного или двух нуклеотидов могут приводить к мутациям со сдвигом рамки считывания. Подобные мутации вблизи конца гена β-цепи. Возникновение гемоглобина Tak является следствием дупликации нуклеотидов АС после 146-го кодона, а гемоглобин Cranston – дупликации AG сразу после 144-го кодона β-цепи. В положениях 145 и 146 этого гемоглобина находятся аминокислоты, которые не встречаются в соответствующем участке у других вариантов β-глобина. Гемоглобин Tak имеет нормальную аминокислотную последовательность до 146-й аминокислоты включительно. Нормальная β-цепь содержит 146 аминокислот. Сдвиг рамки считывания при дупликации двух нуклеотидов в случае гемоглобинов Tak и Cranston приводит к возникновению идентичных рамок вслед за 146-м кодоном. Оба мутантных гемоглобина имеют на С-конце добавочные аминокислотные последовательности, которые кодируются нуклеотидами, расположенными непосредственно за нормальным стоп-кодоном. Терминация трансляции в этом случае происходит с участием нового нонсенс-кодона (UAA) в 158-м положении.

Если дупликации одного или двух нуклеотидов происходит внутри гена, а не у его конца, рамка считывания нарушается на большом протяжении. Маловероятно, что при этом будет синтезироваться функциональная молекула глобина. Дупликации, также как и делеции, возникают, по-видимому, вследствие ошибочного спаривания и последующего негомологичного кроссинговера.

На примере мутаций глобиновых генов можно увидеть причину разнообразия мутаций в одном генетическом локусе, понять сущность явления, которое называют генетической гетерогенностью болезни.

Изучение гемоглобина человека началось с открытия наследственного заболевания – серповидно-клеточной анемии. В 1910г. Херрик обнаружил у студента-негра, страдающего анемией, особую аномалию эритроцитов: они были серповидной формы. Вскоре выяснилось, что такая патология довольно часто встречается у американских негров. Больные страдали от гемолитической анемии, частых болей в кишечнике и скелетных мышцах. Было показано, что больные серповидно-клеточной анемией гомозиготны по гену, который в гетерозиготном состоянии (примерно у 8% американских негров) вызывает гораздо менее выраженное отклонение: присутствие в крови некоторого количества серповидных эритроцитов.

Решающую роль в биохимическом и генетическом анализе этой болезни сыграла работа выдающегося химика Полинга, опубликованная под заголовком «Серповидно-клеточная анемия, молекулярное заболевание». Он писал: «Данные, имевшиеся к началу нашей работы, указывали, что процесс образования серповидных эритроцитов может быть тесно связан с состоянием и природой гемоглобина в эритроцитах».

Авторы исследовали гемоглобин людей, в крови которых обнаруживались серповидные эритроциты, гемоглобин больных людей и здоровых. В работе использовали самый совершенный в то время метод анализа белков – зональный электрофорез по Тизелиусу. В результате были выявлены значительные различия в электрофоретической подвижности гемоглобина, выделенного из эритроцитов здоровых людей, и гемоглобина, выделенного из эритроцитов больных.

У людей, в крови которых наряду с нормальными имеются и серповидные эритроциты, обнаружено 20-45% аномального гемоглобина, такого же как у больных серповидно-клеточной анемией, остальной гемоглобин был неотличим от гемоглобина нормальных индивидов. Эти данные подтверждали предположение о том, что больные серповидно-клеточной анемией гомозиготны по гену, который находится в гетерозиготном состоянии у людей с признаком серповидноклеточности.

В 1956г. Ингрэму, работавшему в Кембридже, удалось точно определить, чем нормальный гемоглобин отличается от серповидноклеточного. При гидролизе молекулы глобина трипсином, образуется около 60 пептидов, которые были разделены в двумерной системе на бумаге в одном направлении с помощью электрофореза, а в другом – с помощью хроматографии. Этим методом (метод «отпечатков пальцев») удалось показать, что гемоглобин серповидных эритроцитов отличается от нормального по подвижности единственного пептида. При дальнейшем анализе этого пептида выяснилось, что гемоглобин серповидных эритроцитов отличается от нормального только по одной аминокислоте: глутаминовая кислота в определенном положении заменена валином. В молекуле глутаминовой кислоты по сравнению с валином имеется дополнительная карбоксильная группировка. Эта разница в зарядах и обуславливает различия в электрофоретической подвижности нормального и серповидноклеточного гемоглобина. Так было выяснено, что образование гемоглобина S вызвано заменой глутаминовой кислоты на валин в 6-ом положении β-цепи.

Наследование

Исследования показали, что легкая форма болезни обычно обнаруживается у гетерозигот по данному признаку – иными словами, у тех, кто унаследовал дефектный ген лишь от одного из родителей и передаст его только половине своих возможных потомков. У этих лиц имеется т.н. гетерозиготная серповидно-клеточная анемия (S–A, или A–S). Хотя они сами практически не больны, и могут никогда не заболеть, они все же носители болезни, причем – до проведения специального тестирования – скрытые носители. Самой тяжелой формой заболевания страдают гомозиготы по дефектному гену, т.е. унаследовавшие его и от матери, и от отца; они передадут этот ген всем своим потомкам. Их состояние называют гомозиготной серповидно-клеточной анемией (S–S). Промежуточная форма заболевания встречается обычно у двойных гетерозигот, т.е. лиц, гетерозиготных как по данной, так и по какой-либо другой гемоглобинопатии (например, у них синтезируется гемоглобин C). В таких случаях говорят о болезни S–C или о каких-то сходных состояниях. Исходя из этих данных, генетики, занимающиеся проблемами гемоглобинопатий и в частности СКА, пришли к выводу, что механизм наследования СКА - аутосомно-рецессивный. Такой точки зрения придерживаются все ученые, книги которых были мной проанализированы. Ни в одной из книг мне не встретилось принятое на Кафедре медицинской биологии и генетики УГМА мнение о том, что механизм наследования СКА – неполное доминирование. Мнение об аутосомно-рецессивном наследовании СКА встречалось в книгах таких ученых как Ярыгин В.Н., Ф. Фогель, А. Мотульски, А.П. Пехов, М. Сингер, П. Берг.

Механизм заболевания

В отличие от всех других замен, эта сильно влияет на растворимость и кристаллизацию гемоглобина в условиях гипоксии. Больные серповидно-клеточной анемией наследуют мутантный ген от обоих родителей и не имеют гемоглобина А. При сравнительно низком уровне гипоксии гемоглобин S у таких больных полимеризуется с образованием пучков и волокон. Аномальные кристаллы гемоглобина нарушают структуру мембраны эритроцитов и обусловливают их серповидную форму. Некоторые из этих клеток остаются необратимо серповидными и преждевременно разрушаются. Серповидные клетки увеличивают вязкость крови и мешают ее нормальной циркуляции в небольших кровеносных сосудах. Вызванная этим гипоксия приводит к образованию еще большего числа серповидных клеток. Возникает замкнутый круг, для которого характерны стазы (замедления кровотока) и эпизодические кризы с болями в животе и скелетных мышцах. Через несколько лет пониженное кровоснабжение часто приводит к некрозу органов, например селезенки, что в свою очередь ведет к их атрофии.

У гетерозиготных носителей, которые имеют один нормальный ген β-глобина HbβА и один мутантный (HbβS), гемоглобин S составляет только 20-45% всего гемоглобина. Клинически такие люди вполне нормальны. Их эритроциты содержат как гемоглобин А, так и гемоглобин S, и по продолжительности жизни не отличаются от нормальных эритроцитов. Серповидноклеточность у таких индивидов сказывается только в условиях гипоксии, например, при нахождении на высоте свыше 3000 метров над уровнем моря.

Серповидноклеточность может проявляться слабее, если в организме помимо гемоглобина S имеется другая редкая форма гемоглобина. Присутствие гемоглобина F в эритроцитах больных с серповидно-клеточной анемией снижает степень агрегации и кристаллизации гемоглобина S, в результате пациенты, у которых гемоглобин F находится в высокой концентрации, имеют слабовыраженные симптомы серповидно-клеточной анемии или не имеют их вовсе. В некоторых случаях присутствие гемоглобина F обусловлено геном, вызывающим постоянный синтез фетального гемоглобина в течение всей жизни. В целом, существует обратная корреляция между количеством гемоглобина F и остротой симптомов серповидно-клеточной анемии. Таким образом, любое увеличение количества фетального гемоглобина приводит к ослаблению клинических симптомов серповидно-клеточной анемии.

С точки зрения популяционной генетики, поразительной особенностью гена серповидноклеточности является его крайне неравномерное распределение в мировой популяции. Впрочем, такое распределение обнаруживает не только этот ген; оно характерно для некоторых других вариантов гемоглобина, например HbC, D, E и талассемии. Однако ген серповидноклеточности встречается наиболее часто. В пределах широкого периэкватериального пояса от Камеруна и Конго до Танзании гетерозиготнось по HbS варьируется от 25% до такого высокого уровня, как 40%. Эта частота слегка понижается в направлении западной части Африки. В северной и южной Африке она значительно ниже; во многих популяциях этих областей HbS встречается только спорадически. В Средиземноморье HbS особенно распространен в Сицилии, Калабрии и некоторых районах Греции. На полуострове Халкидики частота гетерозигот составляет 30%. Ген HbS сравнительно часто встречается в популяциях Южной Индии и обнаруживается в арабских странах. Его нет у коренных жителей Америки, практически отсутствует он и во всех популяциях севера и северо-запада Европы.

По приблизительным данным, в США один из 10 афроамериканцев является носителем болезни, а у одного из 375 наблюдается явная ее форма; в целом же, число больных серповидно-клеточной анемией в США, по оценкам, превышает 50 000.

Гипотеза о малярии