Основы генетической инженерии

 

Л Е К Ц  И Я  №10

 

Основы генетической инженерии.

 

В первой половине  70-х годов ХХ в. развитие молекулярной биологии привело к возникновению  новой экспериментальной технологии, которая получила в СССР название “генная инженерия”, а в западной литературе именуется “работой с рекомбинантными молекулами ДНК”.

Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой два компонента, соединенные в бесклеточной системе: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чужеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя генетические элементы, которые нужно перенести в реципиентную клетку (клетка-хозяин). Генетическая инженерия возникла на стыке многих биологических дисциплин: молекулярной генетики, энзимологии, биохимии нуклеиновых кислот и др. Первая рекомбинантная ДНК получена в 1972 г. (П.Бергом с сотр.) и была составлена из фрагмента ДНК обезьяньего вируса ОВ40 и бактериофага λ dvgal с галактозным опероном Е. coli. Формально 1972 г. следует считать датой рождения генетической инженерии.

 

 

1.Технология  конструирования и работы с  рекомбинантными ДНК

 

Сущность генетической инженерии  сводится к целенаправленному конструированию искусственных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привносят в него новые генетические и физиолого-биохимические свойства, полезные для человека. К числу таких свойств можно отнести синтез аминокислот и белков, гормонов, ферментов, витаминов и др. Источником генетического материала могут выступать различные организмы не способные в обычных, природных условия, к обмену генетической информацией  с организмами - реципиентами.

В настоящее время не существует единого, универсального набора методик, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме.

                  

1.Из организма - донора нужных  генов - экстрагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК), подвергают ее избирательному ферментативному гидролизу по определенным участкам (расщепляют, разрезают) с помощью соответствующих рестриктаз и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирующий вектор - встроенная ДНК»).

2. Эту конструкцию вводят в  клетку-хозяина (реципиент), где она  реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией.

3.Идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки).

4.Получают специфический белковый  продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

Рассмотрим эти процессы поподробнее.

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми бактериальными внутриклеточными ферментами - рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК.

Каждый фермент, способный разрушить  чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов. Соответствующие последовательности в геноме продуцирующих их бактерий замаскированы метилированием остатков дезоксирибозы  с помощью ферментов-метилаз.

Согласно номенклатуре, предложенной X. Смитом и Д. Натансоном, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает родовое название, две последующие - первые буквы вида.

Например, фермент из Е. coli обозначают как Есо или из Haemophilus influenzae - Hin и т.д. Типовая или штаммовая идентификация следует за родовидовой, например, EcoRI или Hindll и т. д. В настоящее время различные фирмы вы пускают более 100 разнообразных ферментов, опознающих различные последовательности нуклеотидов. Для каждого конкретного фермента они различаются по длине, первичной  структуре и способу разрыва молекулы ДНК. Подавляющее большинство ферментов разрывает только двунитевую ДНК с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными (или рестриктами) с тупыми либо липкими концами).

Если рестриктазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов то  на концах фрагментов образуются короткие одноцепочечные участки, способные  образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента (“липкие концы”). Если разрыв происходит без смещения, то образуются фрагменты ДНК c “тупыми концами”.

Один из важнейших этапов конструирования  молекулы рекомбинантной ДНК является лигирование (или сшивание) генов  с помощью фермента ДНК-лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены, может проходить как по “липким”, так и по “тупым” концам. Однако эффективность  сшивки по “тупым” концам  ниже чем по “липким”.

 

-- -- АТГЦААТТ                ЦАГТЦ-- --              -- --ГЦГГ     ЦЦГТ-- --

-- -- ТАЦГ                ТТААГТЦАГ-- --               -- --ЦГЦЦ     ГГЦА-- --

      сшивание          ДНК-лигаза                                       сшивание    ДНК-лигаза

 

 

 

    -- -- АТГЦААТТ—ЦАГТЦ-- -                         -- --ГЦГГ—ЦЦГТ-- --

    -- --ТАЦГ—ТТААГТЦАГ-- --                         -- --ЦГЦЦ—ГГЦА-- --

      сшивание по “липким” концам                      сшивание по “тупым” концам

 

 

При отсутствии комплиментарных “липких” концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, т.е. синтезируют искусственно ферментативным путем. Для этой цели применяют так называемые линкеры (или переходники) – короткие участки ДНК, имеющие разные “липкие” концы, комплиментарные сшиваемым фрагментам.

 

 

                     -- --АТГЦААТТ                ТАЦГ-- --

                     -- --ТАЦГ                 АГГТАТГЦ-- --

                                                  Х  

 

               “Липкие” концы не комплиментарны. Сшивки нет.

 

-- --АТГЦААТТ             ЦТГАГАТЦЦА             ТАЦГ -- --  

-- -- ТАЦГ             ТТААГАЦТЦТ               АГГТАТГЦ-- --

      фрагмент 1                          линкер                                     фрагмент 2

 

-- --АТГЦААТТ-- --ЦТГАГАТЦЦА-- --ТАГЦ-- --

-- --ТАЦГ-- --ТТААГАЦТЦТ-- --АГГТАТГЦ-- --

                               сшивание с помощью линкера

Линкерные фрагменты не только обеспечивают объединение генов, но и обусловливают  их экспрессию, в связи с чем  часто в середину линкера помещают какой либо регуляторный  генетический  элемент, например промотор, или участок связывания с рибосомой.

После того как рекомбинантная ДНК  сшита, ее можно ввести в живые клетки. Но поскольку она не способна к самовоспроизведению, ее быстро разрушат внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в ее геном (в хромосому) и реплицироваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обладать следующими особенностями:

  1.  Иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции, в которые после их разрезания можно встроить нужный ген.

  2. Иметь свойства репликона, т.е самовоспроизводиться.

  3.  Содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникно-вения вектора в клетку придают ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора.

  В частности, для бактериальных векторов в качестве маркерных генов чаще всего используются гены, вызывающие устойчивость клеток к некоторым антибиотикам.

  4. Иметь малый размер и способность проникать через клеточную оболочку

Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроенных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клетки и т.д.

  Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов используют плазмиды. Плазмидами называют специфические бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности), способные к длительному автономному существованию и стабильно наследуемые. Они представляют собой двуцепочечные кольцевые молекулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. По размеру они соответствуют 1 - 3 % от хромосомы  бактериальной клетки. Так, молекулярная масса одной из самых мелких плазмид, найденных у Е. coli, составляет 1,5 МДа, а клетки псевдомонад содержат плазмиды с Мг около 300 МДа, что составляет 15 % от Mв хромосом этих бактерий. Плазмиды разделяют на конъюгативные, способные сами перенестись в реципиентные клетки с помощью конъюгации, и неконъюгативные, не обладающие этим свойством. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды); биодеградацию (D-плазмиды) и др. Например, плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид Е. coli. Плазмиды могут управлять синтезом инсектицида в клетках Bacillus thuringiensis. F-плазмида Е. coli или FP-плазмиды псевдомонад являются половыми факторами. Плазмида  pSIOl с Мг 5,8 МДа несет ген устойчивости к тетрациклину (селективный маркер). У различных микроорганизмов - Е. coli, Salmonella, Bacillus, Saccharomyces обнаружены Col-плазмиды, обеспечивающие синтез разных колицинов - высокоспецифических антибиотиков, подавляющих жизнедеятельность других штаммов микроорганизмов того же вида или родственных видов. Количество плазмид в клетке может колебаться от одной до более ста. В целом, чем крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке.

  Первый плазмидный вектор был получен С.Коэном (1973). Его источником была плазмида Е. coli R_6-5 с Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур.

  Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида (ColE1), относящаяся к группе колициногенных плазмид Е.coli. ColE1 реплицируется независимо от хромосомы и присутствует в количестве примерно 24 копий на клетку. Ее широко используют благодаря селективному маркеру (способность к синтезу антибиотика колицина) в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в Е. coli.

    Плазмида pBR313 содержит уникальные участки расщеплений нескольких рестриктаз: EcoRI, Hindlll, BamHI, Sail, Xmal и Hpal. Конструируя рекомбинантную ДНК, в эти участки можно встраивать фрагменты чужеродной ДНК, полученные с помощью соответствующих рестриктаз.

На рис. изображена схема расположения генов в плазмиде pBR322.

Плазмида pBR322 содержит два гена, программирующих устойчивость к двум различным антибиотикам - тетрациклину (ген tet) и ампициллину (ген blа). В гене tet находятся уникальные участки расщепления рестриктазами HindIII, BamHI и SalI, а в гене blа - участок расщепления PstI. Если разрезать плазмиду любой из рестриктаз, участок расщепления которой находится в гене tet, и соединить ее методом «липких» концов с чужеродным фрагментом ДНК, то в полученной рекомбинантной молекуле останется нетронутым только ген blа, а ген tet утрачивает свою активность, так как его целостность нарушается вставкой. Напротив, при разрезании плазмиды рестриктазой PstI и внедрении в этот участок фрагмента ДНК инактивируется ген blа, тогда как ген tet продолжает кодировать белок, обеспечивающий устойчивость Е. coli к тетрациклину. Плазмидные векторы в настоящее время чрезвычайно разнообразны за счет следующих свойств:

  1.Наличие большого количества участков рестрикции, отвечающих различным рестриктазам.

  2.Возможность уменьшения размеров плазмиды вследствие изъятия участков, не обязательных для репликации и замены их клонируемыми генами.

  3.Гибридизации векторов одного рода с другими векторами или природными плазмидами (например, получены гибридные векторы комбинацией плазмиды и фага λ (при этом вновь сконструированная рекомбинантная ДНК должна сохранить репликационные свойства исходной плазмиды);

  4.Наличие селективных генетических маркеров, позволяющих вести отбор рекомбинантных клонов.

  Эукариотические вирусы до сих пор нашли более скромное применение в качестве векторов. Практически используются только онкогенный вирус SV 40 и его производные. Все эти векторы - дефектные вирусы, не способные давать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. Клонируемую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках, например бактериофаги. Чаще всего из известных фагов в качестве векторов применяют сконструированные производные фага λ и фагов М13 и fd. В векторах на основе бактериофага λ используется его особенность, состоящая в том, что большая часть его ДНК не участвует в размножении фага в клетке и может быть удалена . Это позволяет вводить вместо нее чужеродную, клонируемую ДНК в ДНК фага λ и использовать его в качестве вектора.

  Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (или химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предвари-тельную обработку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток (раствор СаС1₂) за счет увеличения проницаемости клеточной стенки, с последующим их помещением в селективирующую среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком. Другим способом увеличения проницаемости клеточной  стенки является электропорация, когда клеточную суспензию обрабатывают короткими импульсами переменного тока высокого напряжения (порядка 2500 вольт). После такой обработки эффективность трансформации повышается, в зависимости от размеров плазмид, в 10⁶ – 10⁹ раз.