Основы генетической инженерии

  Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.

   Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной (обычно одна из тысячи). Кроме того, часть этих бактерий может содержать исходную, не трансформированную плазмиду. Отделение клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, от общей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клонирования трансформиро-ванную бактериальную суспензию низкой концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар или чаще на нитроцеллюлозные фильтры, помещенные на чашку Петри с питательной средой, из расчета 5 - 10 бактерий на 1 см² поверхности. Бактериальная клетка на поверхности фильтра начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника.

  Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя рассмотренную ранее плазмиду pBR322, содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бактерий в питательную среду добавляют антибиотик - или ампициллин, или тетрациклин в зависимости от того, какой из генов (blа или tet) остался интактным (неповрежденным) после введения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют клетки только с плазмидами (рекомбинантными и нерекомбинантными), а все остальные погибают. Для отделения рекомбинантных бактерий от исходных используют следующую технологию. К фильтру с исходными колониями прижимают свежий нитроцеллюлозный фильтр (фильтр-реплика), который затем переносят на чашку Петри с аналогичной питательной средой, но, содержащей антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих фильтрах дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Анализируя расположение клонов на исходном фильтре, и фильтре-реплике, выделяют колонии, содержащие трансформированные клетки.

  При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод радиоавтографии, основанный на способности двух любых одноцепочечных  комплиментарных фрагментов ДНК спариваться (гибридизоваться) между собой. Если один фрагмент  (ДНК-зонд, гибридизационный зонд) содержит радиоактивную  метку (обычно изотоп фосфора 32 или иода 125), то радиоактивной будет и гибридизованная  молекула ДНК или ее фрагмент.

Технология подготовительного  этапа радиоавтографического скрининга имеет много общего с описанной выше процедурой, используемой при клонировании. Полученную с трансформированной бактериальной колонии фильтр-реплику подвергают щелочной обработке при высокой температуре. При этом клетки в колониях лизируются, а клеточная ДНК денатурируется с разрушением двойной спирали и одиночные цепи связываются с нитроцеллюлозой в том участке, где была расположена соответствующая колония. Далее фильтр подвергают обработке раствором, содержащим специально приготовленные, меченные изотопами, одноцепочечные фрагменты клонируемой ДНК а затем промывают для удаления раствора с ДНК-зондом. На тех участках фильтра, где находились трансформированные клетки будет происходить процесс гибридизации клонируемой ДНК с ДНК-зондом и они окажутся радиоактивными.

   Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы и по синтезируемому ими продукту.  Технически эта процедура имеет много общего с гибридизацией. Все клеточные линии (клоны) высевают на чашки с питательной средой. Выросшие колонии переносят на фильтр, клетки лизируют, а высвободившиеся белки фиксируют на фильтре. Затем на фильтр наносят первые антитела, которые специфически связываются с данным белком (антигеном), все несвязавшиеся антитела удаляют, а фильтр помещают в раствор вторых антител, специфичных в отношении первых антител. Во многих тест-системах используют конъюгаты вторых антител с ферментом, например с щелочной фосфатазой. После отмывания фильтра добавляют бесцветный субстрат. Если вторые антитела связываются с первыми, то под действием фермента происходит гидролиз субстрата с образованием окрашенного вещества в том месте, где идет реакция. Те клетки на чашке, которые соответствуют окрашенным пятнам на фильтре, содержат или полноразмерный ген, или достаточно протяженный его участок, обеспечивающий синтез белкового продукта, узнаваемого первыми антителами. По окончании иммунологического скрининга необходимо дополнительно определить, какой именно из отобранных клонов содержит полноразмерный ген.