Пульс-электрофорез: CHEF – метод

Введение

Пульс-электрофорез — это метод фракционирования высокомолекулярных ДНК (от 10 т. п. н. до 10 млн п. н.) с помощью электрофореза в агарозном геле в условиях периодически меняющегося по направлению («пульсирующего») электрического поля. Этот метод стал одним из ключевых инструментов современной геномики, поскольку он дает возможность манипулировать ДНК целых хромосом или их протяженных участков.

Метод электрофореза ДНК в агарозном геле в условиях действия двух поочередно прилагаемых электрических полей, векторы напряженности которых направлены друг относительно друга под тупым углом, получил в англо-язычной литературе название «гель-электрофорез в пульсирующем поле» (Pulsed Field Gel Electrophoresis —PFGE). В научной литературе на русском языке этот метод стали называть «пульс-электрофорезом» (Смит и др., 1990), или «пульсфорезом» (Межевая и др., 1993). В пульсирующем электрическом поле возможно фракционирование крупных молекул ДНК с размерами в очень широком диапазоне: от 10 т. п. н. до 10 млн п. н. (Orbach et al., 1988; Kuspa et al., 1989; Cooney, 1990). В этом диапазоне находится размер хромосомных ДНК прокариот и низших эукариот; следовательно, пульс-электрофорез позволяет манипулировать ДНК целых хромосом или, как в случае высших организмов, их протяженных участков. Именно поэтому данный метод стал одним из ключевых инструментов современной геномики. В русскоязычной литературе методу пульс-электрофореза посвящены всего два обзора (Смит и др., 1990; Межевая и др., 1993), последний из которых опубликован 15 лет назад.

История и теория пульс-электрофореза

Впервые произвести разделение высокомолекулярной ДНК в электрофоретической системе удалось в начале 80-х годов прошлого века Шварцу с соавторами (Schwartz et al., 1982; Schwartz, Cantor, 1984). До работ этих авторов электрофорез крупных молекул ДНК был невозможен в силу двух основных причин. Во-первых, с использованием обычных методов выделения и очистки не могли быть получены препараты интактной ДНК большого размера. Депротеинизированная ДНК целой хромосомы имеет

контурную длину порядка нескольких миллиметров при диаметре 20 нм. Такие молекулы с осевым отношением около 106 весьма чувствительны к воздействию сил сдвига, в результате чего при использовании обычных методов выделения ДНК они фрагментируются. Во-вторых, в ходе обычного электрофореза молекулы ДНК размером более 50 т. п. н. движутся в геле с практически одинаковой скоростью и, следовательно, не фракционируются по размерам.

Для разделения ДНК целых хромосом дрожжей Saccharomyces cerevisiae размером 200—2200 т. п. н. Шварц и соавторы предложили два принципиально новых подхода, позволивших решить проблему очистки и фракционирования таких крупных ДНК. Эти исследователи разработали оригинальную методику, позволяющую экстрагировать интактную хромосомную ДНК из клеток, заключенных в легкоплавкую агарозу, и сконструировали аппарат для электрофореза, в котором крупные молекулы

ДНК могли быть разделены в агарозном геле при периодическом изменении направления прилагаемого электрического поля.

Шварц и соавторы связывали эффект разделения молекул в агарозном геле в условиях пульсирующего электрического поля с разным временем переориентации молекул, различающихся по размеру. По мнению этих авторов, при изменении направления приложения электрического поля более крупные молекулы дольше переориентируются и, следовательно, отстают от более мелких, что и приводит к разделению молекул по размерам. Как показали последующие исследования, эта элегантная гипотеза оказалась не совсем верной. Механизм разделения молекул связан с разными формами движения ДНК в каждой точке геля (рис. 3). В результате удается добиться того, что дорожки в CHEF-гелях всегда прямые, а качество разделения ДНК стабильно высокое. Из всех известных вариантов пульс-электрофореза CHEF получил наиболее широкое распространение, так как обеспечивает наиболее эффективное фракционирование молекул ДНК разного размера. Например, именно в этой системе стало возможным практически полное разделение всех хромосом в кариотипе дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В ранних работах в молекулярном кариотипе дрожжей удалось разрешить только 11—12 полос, некоторые гетерологичные хромосомы комигрировали в одной полосе (Schwartz, Cantor, 1984; Carle, Olson, 1985).

Чу и соавторы при исследовании молекулярного кариотипа S. cerevisiae

наблюдали в CHEF-геле 15 полос. Авторам удалось разделить 14 из 16 хромосом этого организма (Chu et al., 1986).

 Кроме приведенных выше вариантов пульс-электрофореза в литературе описаны электрофоретические установки, в которых пульсирующее электрическое поле создается не за счет переключения напряжения на электродных парах, а за счет вращения геля, помещенного на горизонтальную платформу, поворачиваемую на заданный угол через определенные промежутки времени («вращающийся гель в постоянном поле» — Rotating Gel in a Constant Field — RGCF, Anand, 1986; «электрофорез с вращающимся гелем» — Rotating Gel Electrophoresis—RGE, Southern et al., 1987), или в которых гель остается неподвижным, а катод и анод являются частями вращающегося ротора («гель-электрофорез с вращающимся полем» — Rotating Field Gel Electrophoresis — ROFE, Ziegler et al., 1987).

Предложены и некоторые другие модификации пульс-электрофореза, однако большинство наиболее признанных и широко используемых в настоящее время коммерческих установок базируется на принципе CHEF. Таковы, например, CHEF-DR®III Pulsed Field Electrophoresis System (Bio-Rad Laboratories, США) и Gene NavigatorTM

System (Pharmacia Biotech — в настоящее время GE Healthcare Bio-Sciences, Швеция).

Факторы, определяющие эффективность

фракционирования молекул

Кроме упомянутых выше факторов, критичных для успешного выделения ДНК и ее фракционирования в пульсирующем поле, таких как использование специальных щадящих методов очистки нативной высокомолекулярной ДНК и особое расположение электродов в электрофорезной  камере,  существует еще целый ряд параметров, влияющих на подвижность молекул и эффективность их разделения: время пульса и режим его изменения, напряженность поля, угол переориентации вектора напряженности поля, суммарная длительность электрофореза, концентрация агарозы, концентрация и температура буфера; причем все эти параметры взаимозависимы.

Время пульса (в англоязычной литературе используют целый ряд названий этого параметра: pulse time, switch time, switch interval). Это промежуток времени, через который осуществляется изменение («переключение») направления электрического поля. После первых же опытов по фракционированию ДНК в пульсирующем поле стало понятно, что именно время пульса — это наиболее критичный параметр для успешного разделения молекул. Чем больше размер фракционируемых молекул, тем реже должно производиться переключение электрических полей. Шварц и Кантор объяснили этот эффект тем, что время, необходимое для переориентации молекулы ДНК при переключении направления поля, зависит от ее размера. Исследователи предполагали, что оптимальным временем пульса для молекул ДНК данного размера оказывается такой промежуток времени, за который они успевают переориентироваться и только еще начинают движение в новом направлении. Более крупные молекулы при том же времени пульса не успеют закончить переориентацию и, следовательно, позже начнут мигрировать в новом направлении, т. е. их продвижение в геле будет заторможено. Более короткие молекулы будут мигрировать в одном и том же направлении слишком длительное время (как в случае обычного электрофореза в постоянном поле), и, следовательно, эффективность их разделения будет невелика (Schwartz, Cantor, 1984). В соответствии с современными представлениями о механизме миграции молекул ДНК в пульсирующем поле корректнее принимать во внимание время, необходимое для возвратного движения, а не время, необходимое для переориентации (Gurrieri et al., 1996). Однако основная закономерность, прослеженная исследователями на заре становления метода пульс-электрофореза, остается прежней: при неком значении времени пульса только молекулы одного какого-то размерного класса оказываются в оптимальных для разделения условиях и могут быть эффективно фракционированы.

Таким образом, для разделения молекул ДНК с широким диапазоном размеров необходимо подобрать режим последовательного возрастания времени пульса (рис. 4, А). Изменение этого параметра в ходе электрофореза называют «рампингом» (ramping, от ramp — изменение по линейному закону). Время пульса может возрастать либо непрерывно, либо прерывисто — через ряд дискретных значений. Непрерывное возрастание времени пульса от минимального до максимального из заданных значений в течение заданного промежутка  времени получило название «интерполяция» (interpolation, от interpolar — между двумя полюсами, между двух значений).

Альтернативный вариант — ступенчатое возрастание времени пульса — называют «степпингом» (stepping, от step — ступень). Область в геле после проведения пульс-электрофореза, где достигнуто эффективное разделение молекул ДНК, называют «зоной разрешения» (resolution window). Эффективность разрешения молекул в геле характеризуется расстоянием между полосами с хромосомными ДНК близкого размера (band spacing), а также шириной и четкостью полос (band sharpening). Зависимость между скоростью миграции молекул ДНК и их размером в зоне раз решения линейная, поэтому для молекул ДНК, мигрирующих в этой зоне, можно точно определить размер.

Напряженность поля. Эффективность разрешения — это функция не только времени пульса, но и напряженности используемого электрического поля. В целом чем больше напряженность поля, тем выше скорость миграции молекул. Однако чем больше размер молекул, тем больше эта зависимость отклоняется от линейной (Cantor et al., 1988).  Для разделения молекул размером до 1 млн п. н. используется напряженность поля 6—10 В/см. Чем ниже напряженность поля, тем выше разрешение, но уже диапазон размеров разрешаемых молекул (Birren et al., 1988). Слишком высокие значения напряженности (выше 10 В/см) приводят к плохому разделению молекул

и появлению так называемых шмеров (smears) — зон равномерного окрашивания ДНК, в которых не удается визуально идентифицировать отдельные полосы (Mathew et al., 1988b; Chu, 1990). Для крупных молекул (более 1 млн п. н.) при высоких значениях напряженности поля начинает сказываться эффект захвата (trapping effect) — спонтанная перманентная иммобилизация молекул в геле, обусловленная специфическим необратимым изменением их конформации. В связи с этим для фракционирования таких молекул предпочтительно использовать низкую напряженность поля (1—3 В/см) (Gunderson, Chu, 1991; Gurrieri et al., 1999).

Время пульса и напряженность электрического поля являются взаимосвязанными факторами. Предел разрешающей способности пульс-электрофореза определяется следующей функцией («window function» — Chu, 1990):

W = E1.4 · Tp, где E — напряженность электрического поля, Tp— время пульса. Чем выше значение этой функции, тем больше размер молекул ДНК, которые могут быть эффективно разделены. Очевидно, что разделение молекул ДНК одного и того же размерного диапазона может достигаться при использовании различных значений времени пульса, если величина напряженности электрического поля при этом меняется таким образом, что значение функции W остается неизменным.

Угол переориентации. Этот параметр в некоторых аппаратах для пульс-электрофореза фиксирован, в других его можно варьировать в пределах от 90 до 180°. Показано, что изменение угла переориентации не оказывает заметного влияния на миграцию молекул с размером менее 1 млн п. н. Подвижность более крупных молекул возрастает при уменьшении угла, однако при этом заметно уменьшается разрешение отдельных полос в геле

(Clark et al., 1988; Chu, Gunderson, 1991). Эмпирически было установлено, что наилучшее разделение достигается при величине угла более 110° (Cantor et al., 1988), поэтому чаще всего используют угол переориентации 120°.

Концентрация агарозы в геле. Повышение концентрации агарозы в геле при пульс-электрофорезе оказывает менее заметное влияние на подвижность молекул ДНК, чем при электрофорезе в постоянном поле. Установлено, что в геле с концентрацией агарозы 1.2 % молекулы разделяются несколько эффективнее, чем в 0.9%-ном геле. При дальнейшем увеличении концентрации агарозы подвижность молекул ДНК снижается и увеличивается продолжительность электрофореза, но разрешение заметно не улучшается (Mathew et al., 1988a). В связи с этим при разделении молекул, размер которых не превышает 3 млн п. н., стандартно используются гели с концентрацией агарозы 1.0—1.5 %.

Состав и температура электрофорезного буфера. Для пульс-электрофореза обычно используют буферы с высокой ионной силой: ТРИС-боратный (0.5 %

ТВЕ) или ТРИС-ацетатный буфер (1 % ТАЕ). Электрофоретическая подвижность молекул ДНК при пульс-электрофорезе сильно зависит от температуры буфера: чем выше температура, тем выше скорость миграции молекул (Mathew et al., 1988a). Обычно пульс-электрофорез проводят при температуре в диапазоне 12—16 °С (Chu, 1990). При более высокой температуре буфера полосы становятся слишком широкими и диффузными, что приводит к заметному снижению разрешения и появлению шмеров.

Считается, что повышение температуры буфера приводит либо к формированию конформаций молекул, препятствующих их быстрой переориентации в геле, либо к изменению свойств агарозного матрикса (Mathew et al., 1988a). Таким образом, поддержание постоянной температуры электрофорезного буфера является необходимым условием получения хорошего разделения молекул ДНК.

Области применения метода

Пульс-электрофорез нашел широкое применение в геномике прокариот и эукариот. Использование электрофореза в пульсирующем поле в совокупности с другими молекулярными методами дает возможность установить локализацию клонированных последовательностей на хромосомах, произвести физическое картирование геномов и уточнить тонкую структуру физических и генетических карт хромосом у самых разных объектов. Именно применение пульс-электрофореза для фракционирования

высокомолекулярных фрагментов ДНК, полученных при рестрикции нативной ДНК редкощепящими эндонуклеазами, позволило в 1987 г. получить первую карту генома бактерии Escherichia coli, штамм К12 (Smith et al., 1987), а 2 года спустя — первую полную рестрикционную карту генома эукариотического организма — дрожжей  Schizosaccharomyces pombe (Fan et al., 1989). С тех пор этот метод эффективно используют для картирования геномов эубактерий и архей (Dingwall et al., 1990; Smith, Condemine, 1990; Bautsch, 1992; Fujiwara et al., 1996) и для анализа процесса репликации у этих организмов, в частности для локализации точек начала и конца репликации, определения времени инициации репликации в клеточном цикле и порядка репликации генов, а также для оценки скорости процесса (Pyle, Finch, 1988; Dingwall, Shapiro, 1989; Ohki, Smith, 1989). Сравнение паттернов фрагментов рестрикции ДНК бактериальных хромосом, которые разделяют с помощью пульс-электрофореза, находит и практическое применение, в частности при идентификации штаммов микроорганизмов в медицине, промышленности и сельском хозяйстве (см., например: Correia et al., 1994). Этот метод используют и в молекулярной экологии, например