Бумажная хроматография

 

                                   Содержание работы:  

1. Теоретическая часть.

1. Понятие бумажной хроматографии………………………………3

Классификация…………………………………………………….3

Носитель…………………………………………………………....3

Методика……………………………………………………………4

Сущность  метода, аппаратура и материалы………………………6

Проведение  испытаний…………………………………………….7

Сорбенты……………………………………………………………10

2. Практическая часть.

         Идентификация ЛРС, содержащего кумарины ………………………12

         Идентификация ЛРС, содержащего  алкалоиды………………………13

        Идентификация ЛРС, содержащего антраценпроизводные…………15

Вывод…………………………………………………………………………..16

    Список литературы……………………………………………………………17

Приложения……………………………………………………………………18 
 
 
 
 
 
 
 
 

Бумажная  хроматография — метод анализа состава исследуемого образца. Был открыт в 1944 году Констоном, Гордоном, Мартином и Сенджем, которые использовали его для анализа смесей аминокислот. Мартин и Сендж впоследствии были удостоены Нобелевской премии за открытие распределительной хроматографии. В последующие 10 лет этот метод получил огромное распространение, но с 1952 года бумажную хроматографию начал вытеснять новый метод тонкослойной хроматографии (являющийся по сути обобщением бумажной). Последний оказался эффективнее благодаря большей скорости эксперимента, пригодности для препаративных целей и более широким возможностям обнаружения. Поэтому сейчас бумажная хроматография уже практически не применяются, а методы её давно не совершенствуются.

1. Классификация

Бумажной  хроматографию, как и хроматографию  вообще, можно разделить на распределительную, адсорбционную и ионообменную, а также на препаративную и аналитическую. В распределительной бумажной хроматографии можно выделить нормальную и обращённо-фазную хроматографию. В последнем случае (в отличие от нормального подхода) неподвижная фаза более липофильна, чем подвижная. Этот метод применяется для разделения липофильных веществ.

2. Носитель

При распределительной  БХ носителем неподвижной фазы является целлюлоза в виде листов бумаги, которая даже в высушенном виде содержит значительное количество связанной воды. Распределение происходит между связанной водой и растворителем, хотя присутствуют и адсорбционные эффекты. Для БХ применяется качественная бумага, которая может быть модифицирована в соответствии с поставленными задачами. Также используется бумага из стекловолок- 
 

на, которая  устойчивы к коррозионно-активным реагентам и обладает низкой адсорбционной  способностью.

Один  из наиболее ранних способов модифицирования  хроматографической бумаги — ацетилирование. Бумага, полученная таким образом, используется для обращённо-фазной хроматографии. Позднее было обнаружено, что эта бумага пригодна и для разделения рецемических смесей, так как ацетилцеллюлоза сама является хиральным веществом и потому энантиомеры перемещаются по ней с различной скоростью. Как носители неподвижной липофильной фазы применяются также силиконы.

Методика

В бумажной хроматографии вещества различаются  по их относительному положению на бумаге после того, как растворитель пройдёт определённое расстояние. Небольшое количество раствора смеси (10-20мкл), которую нужно разделить, наносят в отмеченную точку на бумаге и высушивают. Полученное пятно называют стартовым. Затем бумагу помещают в герметичную камеру и один её конец погружают в растворитель, который является подвижной фазой. Под действием капиллярных сил растворитель движется по бумаге, растворяя и увлекая за собой компоненты образца. До начала движения образец должен полностью раствориться, поэтому скорость растворения компонентов в подвижной фазе является одним из факторов, определяющих эффективность разделения. После того, как растворитель пройдёт определённое расстояние, лист вынимают и сушат. Затем образовавшиеся пятна, которые могут быть как видимые, так и невидимые, обнаруживают и отмечают.

Отношение расстояния, пройденного пятном, к расстоянию, пройденному растворителем стандартно обозначается Rf. Эта величина зависит от вещества, бумаги и природы растворителя. Бумажные хроматограммы могут проявляться в восходящем, нисходящем и горизонтальном токе растворителя, что слабо отражается на их качестве. Поэтому выбор определяется другими факторами: по  

сравнению с восходящей хроматографией нисходящая имеет определённые преимущества. А  именно, она требует меньше времени  и не ограничена по длине пробега. С другой стороны, для нисходящей БХ играет важную роль тщательность подготовки камеры, так как загрязнение или плохой контакт бумаги в месте соприкосновения со стенкой лодочки может приводить к неоднородному току и, как следствие, образованию полос.

Буш и  Кроушоу предложили методику скоростной БХ. Эта методика предусматривает применение более узких камер, горизонтальное хроматографирование, насыщение атмосферы камеры парами растворяющей системы, а главное — предварительную пропитку бумаги водной неподвижной фазой. Нередко весьма эффективна оказывается т. н. двумерная БХ, которая заключается в том, что после проведения хроматографии в одном направлении бумагу высушивают и повторно хроматографируют с другим растворителем под прямым углом к первоначальному направлению. При этом часто происходит разделение веществ, которые не разделяются в первом растворителе.

Обнаружение

Пятна на хроматограммах могут быть обнаружены по цвету, флуоресценции, с помощью  химических реакций, для чего бумагу опрыскивают или погружают в  различные реагенты, или же по радиоактивности. Идентификацию проводят обычно путём сравнения с образцами с известными величинами Rf или после элюирования, которое сводится к вырезанию зоны, содержащей пятно, и последующему промыванию её соответствующим растворителем. 
 
 
 
 

1. СУЩНОСТЬ МЕТОДА

  Метод заключается в разделении на хроматографической бумаге смеси веществ в потоке растворителя, основанном на различной скорости перемещения компонентов смеси.

2. АППАРАТУРА И МАТЕРИАЛЫ

1. Камера   (сосуд)   хроматографическая,  закрытая  герметичной крышкой.
2. Лампа ультрафиолетовая для обнаружения веществ с использованием флуоресценции при длине волны от 254 до 366 нм.
3. Микропипетка   вместимостью 0,002—0,010  см³  или микро шприц вместимостью не более 0,01 см³.
4. Пульверизатор для распыления проявителя.
5. Бумага хроматографическая.
6. Денситометр.
7. Устройство для сканирования пятен на бумаге.

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

4.1.Подготовка  хроматографической бумаги

В зависимости  от размеров хроматогрофическорй камеры из хроматографической бумаги    вырезают полоски с ровной или зубчатой кромкой или кружки соответсвующих размеров, на которых мягким карандашом обозначают пробу, систему растворителей, дату и линию старта с точками для нанесения пробы. Рекомендуемое расстояние между точками для нанесения пробы 20 – 30 мм, расстояние от линии старта до кромки бумаги – 30 мм.

  При  необходимости перед испытанием  бумагу обрабатывают специальным раствором и высушивают при комнатной температуре в вертикальном положении стартом вниз.

4.2. В  точки, отмеченные на линии старта, наносят с помощью калиброванной микропипетки или микрошприца 0,002 – 0,010 см³ испытуемого раствора, если в нормативно-технической документации на испытуемые реактив нет других указаний. При необходимости в точки на линии старта наносят таким же образом растворы веществ, соответствующих предполагаемым компонентам смеси, для идентификации и количественной оценки этих примесей. Допускается наносить пробу не в виде точки, а чертой с применением микропипетки или капилляра. После нанесения пробы на непропитанную бумагу растворителю дают свободно испариться. Если проба не содержит летучих компонентов, а бумага не пропитана органической неподвижной фазой, испарение растворителя можно ускорить струей горячего воздуха. Бумагу с нанесенной пробой помещают в хроматографическую камеру (пропитанные бумаги помещают в камеру сразу после нанесения раствора пробы).

  При круговой хроматографии пробы наносят  на окружность, описанную на расстоянии нескольких сантиметров от центра хроматограммы. 
 
 

4.  ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЙ

5.1. Хроматографирование

  Хроматографическое  разделение веществ проводят в хроматографической камере, в замкнутой системе, насыщенной парами подвижной фазы, при температуре, указанной в нормативно-технической документации на испытуемый реактив, поместив эту фазу в чашку на дно камеры. Если в нормативно-технической документации на испытуемый реактив нет других указаний, хроматографирование заканчивают, когда фронт подвижной фазы достигнет

  определенного расстояния от старта, например 250 мм. Хроматографирование проводят одним из указанных ниже способов.

5.1.1. Нисходящая хроматография

  В камере для нисходящей хроматографии  должен быть желобок или лодочка. Конец листа хроматографической бумаги с нанесенными пробами, ближний к линии старта, дважды перегибают, помещают в желобок или лодочку, закрепляют стеклянной палочкой, как показано на черт. 5 приложения 1. Затем в желобок помещают подвижную фазу.

5.1.2. Восходящая хроматография

  Хроматографическую  бумагу подвешивают в хроматографической камере так, чтобы ее нижний конец был погружен в слой подвижной фазы на дне сосуда, как показано на черт. 4 приложения 1, а уровень подвижной фазы находился в 10 мм ниже линии старта.

5.1.3. Горизонтальная хроматография

Испытания  проводят,  как показано на  черт. 2  приложения   1.

5.1.4. Круговая хроматография

При круговой хроматографии подвижную фазу помещают в середину хроматограммы, откуда она передвигается к  периферийной части, как показано на черт. 3 приложения 1. В качестве хроматографической  камеры   допускается   использовать   две   чашки Петри или эксикатор.

5.1.5. Проточная хроматография

  Если  хроматографируемые вещества имеют  в определенной системе низкие значения Rf, нижнюю кромку исходящей хроматограммы делают зубчатой. Когда подвижная фаза достигнет конца хроматограммы, разделение продолжают так, чтобы элюирующий растворитель стекал по каплям на дно камеры.

5.1.6. Повторная хроматография

  Метод, при котором по завершении первого  продвижения подвижной фазы хроматограмму высушивают и хроматографирование повторяют (возможно несколько раз). 
 

5.1.7. Многомерная хроматография

  Метод, при котором по завершении первого  продвижения подвижной фазы хроматограмму поворачивают (например под углом 90°) и снова проводят хроматографирование. Перед повторным хроматографированием испаряют подвижную фазу.

5.2. С у ш к а х р о м а т о г р а м м

  По  окончании разделения хроматограмму  вынимают из камеры и отмечают фронт мягким карандашом, после чего сушат при комнатной температуре в вертикальном положении, стартом вниз. Продолжительность сушки зависит от скорости испарения подвижной фазы и химической стабильности хроматографируемых веществ.

5.3. Проявление хроматограмм

  Проявление  компонентов на хроматограмме проводят одним из способов, приведенных ниже.

5.3.1. Физические методы

  Визуально, при дневном свете, отмечают на хроматограмме  положение пятен — цветных веществ. При наличии флуоресцирующих веществ проявление проводят в УФ-свете.

5.3.2. Химические методы

  Хроматограммы проявляют жидкими и газообразными проявителями, используя реакцию имеющихся на хроматограмме соединений с подходящим реагентом-проявителем с образованием окрашенного или флуоресцирующего вещества. Жидкие проявители наносят пульверизатором или используют реагенты в аэрозольной упаковке, газообразные применяют, поместив хроматограмму в пары проявителя.