Бумажная хроматография

1. Хроматограмму   кладут   горизонтально   на   лист   фильтровальной бумаги или оставляют подвешенной на стеклянной палочке и опрыскивают как можно более мелкими  каплями  (туманом)   проявителя  всю  площадь хроматограммы вначале с одной, а потом с другой стороны.

 
 

  5.3.2.2.При   проявлении  газообразным  проявителем    хроматограмму подвешивают в камере,  в которую помещен летучий  реагент (например, кристаллы йода), или на дне которой проявитель получают химическим путем (например, оксиды азота получают путем добавления твердого нитрита натрия к раствору соляной кислоты).

5.3.3.  Биологические методы

  Хроматограммы проявляют, используя биологическую  активность хроматографируемых веществ.

Сорбенты

Силикагель - гидратированная окись кремния, образующаяся при действии минеральных кислот на силикат натрия и сушкой образовавшегося золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости (указанную на пластинке, обычно 5-20 мкм). Силикагель является полярным сорбентом, у которого в качестве активных центров служит группы -ОН. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует водородные связи.

Окись алюминия. Окись алюминия является слабо основным адсорбентом и  используется в основном для разделения соединений слабоосновного и нейтрального характера. Недостатком пластин на окиси алюминия является обязательная активация поверхности перед использованием в сушильном шкафу при высокой температуре (100-150 ⁰С) и низкая, по сравнению с силикагелем адсорбционная емкость слоя.

Кизельгур - адсорбент, полученный из природных  минералов: диатомовых земель. Сорбент обладает гидрофильными свойствами, но более низкой адсорбционной емкостью слоя по сравнению с силикагелем.

Кремнекислый  магний менее полярный чем силикагель и обычно используется в случаях, когда более полярные адсорбенты не дали эффективного разделения.

Целлюлоза - тонкослойные пластины с нанесенной целлюлозой очень эффективны для разделения сложных органических молекул. Адсорбент представляет собой в основном шарики целлюлозы диаметром до50 мкм, закрепленные на носителе крахмалом. Но, как и в бумажной хроматографии, подъем фронта растворителя происходит очень медленно.

В ионообменных хроматографических пластинках в качестве адсорбента используют ионообменные смолы, содержащие четвертичный аммоний или активные сульфогруппы, участвующие в ионном обмене. Тонкослойная хроматография с такого типа пластинками, проводится с подвижными фазами, содержащими сильные кислоты или щелочи. Данные пластинки эффективны для разделения высокомолекулярных и амфотерных соединений. Помимо вышеперечисленных существуют множество веществ, используемых как сорбенты. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Идентификация ЛРС, содержащего  кумарины. 

Приготовление извлечения из растительного сырья. 2 г измельченного сырья (плоды амми большой, пастернака посевного, псоралеи костянковой, корней горичника и порезника густоцветного и др.) заливают 20 мл этилового спирта и кипятят в течение 15 мин с обратным холодильником. После охлаждения фильтруют.

Хроматографическое   определение.   3 а.   После проведения качественных реакций  из оставшейся   части спиртового  извлечения  берут 0,01  мл и наносят на  пластинку «Силуфол» или силикагеля  (закрепленный слой) и  хроматографируют  в системе  н-гексан — бензол — метиловый  спирт   (5:4:1) до тех пор, пока линия фронта не достигнет расстояния  10 см от линии старта. После этого хроматограмму высушивают на воздухе в течение 10 мин, опрыскивают 10%-ным КОН в метаноле и высушивают в сушильном шкафу при t = 110—120 ^оС в течение 2—3 мин. Затем   опрыскивают  свежеприготовленным   реактивом   Паули   по Кутачеку.   При   наличии   кумаринов  в сырье  на  хроматограмме проявляются яркие пятна от кирпично-красного до сине-фиолетового окрашивания в зависимости от структуры кумаринов. 
 

 3б. 0,01 мл спиртового извлечения наносят на полосу хроматографической бумаги марки «Б» размером 14 X 65 см, предварительно   импрегнированной    10 %-ным   формамидом   в   метиловом спирте, и хроматографируют нисходящим методом в смеси растворителей петролейный эфир — бензол — метиловый спирт (5:4:1) в течение 3—4 ч. Хроматограмму высушивают на воздухе в течение 10 мин, опрыскивают 10 %-ным КОН в метиловом спирте и высушивают в сушильном шкафу при t = 110—120 °С в течение 2—3 мин, затем опрыскивают диазореактивом Паули  по Кутачеку. При наличии   кумаринов  в  сырье   па  хроматограмме  появляются  яркие пятна от кирпично-красного до сине-фиолетового окрашивания. 
 

Идентификация ЛРС, содержащего  алкалоиды. 

Алкалоиды в растительном сырье обычно содержатся в виде солей, поэтому до извлечения необходимо перевести соли алкалоидов в свободные основания, что достигается обработкой сырья различными щелочами (КН₄ОН, КаОН, Са(ОН)₂, Ва(ОН)₂ и др.). При подборе щелочи учитывают свойства алкалоидов. Сильные щелочи, например NаОН, используют при выделении сильных оснований алкалоидов и алкалоидов, находящихся в растительном сырье в виде прочных соединений с дубильными веществами (кора хинного дерева, кора гранатового дерева), но не применяют при выделении алкалоидов, имеющих в молекуле фенольные гидроксилы. Такие алкалоиды, как, например, морфин, сальсолин, некоторые алкалоиды спорыньи, вследствие образования фенолятов органическим растворителем не извлекаются, так- как феноляты, как правило, хорошо растворимы в воде и нерастворимы в органических растворителях. Для переведения их солей в основания используют обычно аммиак. При выделении алкалоидов, имеющих сложноэфирную группировку (атропин, гиосциамин, скополамин и др.) также используют аммиак и другие слабые щелочи, так как сильные щелочи могут вызывать разложение алкалоидов. Не следует применять N3014 и при выделении алкалоидов из семян, содержащих жирные масла, так как едкие щелочи вызывают омыление жиров. Мыла же способствуют образованию эмульсий. 

          Разделение суммы алкалоидов. В растительном сырье обычно содержится не один, а несколько алкалоидов, и в большинстве случаев при обработке растительного сырья в извлечение переходят все или большинство алкалоидов (сумма). Отделить один «нужный» алкалоид от остальных, а тем более разделить сумму алкалоидов на индивидуальные соединения очень сложно. Так как большинство алкалоидов обладает различными физическими и химическими свойствами, предложить единую схему разделения трудно. Описано большое число методов и их различных модификаций, позволяющих разделить сумму алкалоидов на отдельные алкалоиды.

  Разделение  сум мы алкалоидов на основании их различной растворимости в органических растворителях.

1. В некоторых случаях частичное разделение происходит ужепри обработке органическим растворителем первоначального воднокислотного извлечения после подщелачивания. При его обработке,например, этиловым эфиром в органический растворитель могутперейти не все, а только часть алкалоидов. Оставшиеся в первоначальном   растворе  алкалоиды  можно   извлечь,   используя   для 
этого другие органические растворители  (хлороформ, дихлорэтан и др.). Иногда таким способом можно достигнуть хороших результатов. Но чаше у алкалоидов одного растения различие в раствори 
мости бывает выражено не очень резко и поэтому достигается только частичное разделение. В таких случаях требуется или повторное проведение этой операции, или применение другого способа разде 
ления.

2. При   последовательной обработке остатка  (суммы алкалоидов), полученного после отгонки растворителя, различными органическими растворителями (петролейный эфир, бензол, хлороформ и 
др.) в некоторых случаях можно достигнуть частичного разделения суммы алкалоидов. 
 

          Чаще всего используют следующие системы растворителей;  1) м-бутанол — уксусная кислота — вода (5:1: 4);   2)   н-бутанол — уксусная   кислота — вода   (10 : 2 : 5); 3) н-бутанол — соляная кислота — вода (100 ; 4: вода до насыщения);  4) этилацетат—уксусная  кислота—вода   (11   : 21   : 85); 5) н-бутанол — пиридин — вода (10 : 2 ; 5) и -др.

  Для обнаружения алкалоидов высушенную хроматограмму обрабатывают каким-либо реактивом, дающим с алкалоидами окрашенные соединения. Чаще всего для этого используют реактив Драгендорфа. При обработке хроматограммы этим реактивом появляются оранжевые или оранжево-красные пятна (алкалоиды) на желтом фоне. Можно для обнаружения алкалоидов использовать пары иода (образуются бурые пятна). Для обнаружения стероидных алкалоидов можно использовать насыщенный хлороформный раствор .треххлористой сурьмы с последующим нагреванием при 105 "С. Появляется кирпично-красное окрашивание. 
 

Идентификация ЛРС, содержащего  антраценпроизводные.

  При исследовании состава антрагликозидов готовят водные извлечения: при анализе состава агликонов сырье экстрагируют бензолом, этиловым или метиловым спиртом, которые при нагревании более или менее удовлетворительно экстрагируют как свободные антраценпроизводные, так и их гликозидные формы.

  0,3 г измельченного  растительного материала нагревают  с 3 мл этилового спирта в течение 5 мин, доводя до слабого кипения. После остывания фильтруют. 0,1 мл фильтрата наносят па линию старта и хроматографируют в системе этилацетат — метиловый спирт — Вода (100 : 17 : 13) на пластинках «Силуфол». Время хроматографирования 30—40 мин. Хроматограмму высушивают на воздухе, обрабатывают 5%- ным КаОН в этиловом спирте и рассматривают при дневном свете и УФ свете до и после обработки. Одновременно хроматографируют стандарт «свидетель», нанося его раствор рядом с исследуемым извлечением. По величине R₁, характеру окраски и флуоресценции пятен идентифицируют антраценпроизводные исследуемого сырья . 
 
 
 
 
 
 
 
 

                                                          Вывод.

Использование хроматографии на бумаге имеет ряд  существенных недостатков: зависимость процесса разделения от состава и свойств бумаги, изменение содержания воды в порах бумаги при изменении условий хранения, очень низкая скорость хроматографирования (до нескольких суток), низкая воспроизводимость результатов, поэтому сейчас бумажная хроматография уже практически не применяются, а методы её давно не совершенствуются.

Метод тонкослойной хроматографии оказался эффективнее благодаря большей скорости эксперимента, пригодности для препаративных целей и более широким возможностям обнаружения 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

                                            Список литературы. 
 
 

1. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. Н.И. Гринкевича, Л.Н. Сафронича. М., 1983. 176 с.
2. Избранные лекции по фармакогнозии. Учебное пособие/ Левинова В.Ф, Решетникова М.Д, Хлебников А.В. Под ред.Олешко Г.И.- Пермь – Изд.3,2006. – 305 с.
3. Избранные лекции по токсикологической химии/ Под ред.Малковой Т.Л. Пермь, 2005. – 152с.
4. Фармакогнозия: Д. А. Муравьева, И. А. Самылина, Г. П. Яковлев — Москва, Медицина, 2007 г.- 656 с.
5. Зайчикова С. Г., Самылина И. А. Химико-фармацевтический журнал. Том 35 № 5, 2001
6. ГОСТ 28365 – 89. Реактивы. Метод бумажной хроматографии.

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

                    Приложения