Общая схема метода масс-спектрометрии

1.     Введение

В конце XX столетия из всех ежегодно производимых в мире приборов для научных исследований на долю масс-спектрометров приходилось около 5 %. Едва ли можно назвать другие методы, которые имели бы столь широкое применение, какое имеет масс-спектрометрический метод, кроме разве что непревзойденного по его способности и глубине проникновения в недра строения вещества спектроскопического метода. Нашедшая первоначально свое применение в физике изотопов, масс-спектрометрия в настоящее время – один из наиболее широко используемых методов в химии, геологии, биологии и других областях науки.

В 1912 году английский физик Дж. Дж. Томсон, используя свой прибор – первый прототип будущих масс-спектрометров, впервые разделил различные массовые компоненты химических элементов. Оказалось, что неон имеет две разновидности атомов, имеющие относительные массы 20 и 22. В настоящее время известно, что существует также и третий изотоп – 10Ne21. Таким образом, впервые были измерены массы различных изотопов, то есть атомов одних и тех же элементов, но с различными массами. Несколькими годами позже Ф.У. Астоном было открыто 212 стабильных изотопов различных элементов, а масс-спектрометрия и по сей день остается основным методом определения масс ядер.

В 80-е годы был найден метод перевода в газовую фазу нелетучих органических соединений в виде ионов, и масс-спектрометрия превратилась в универсальный метод определения молекулярных масс больших молекул, несмотря на то, что большинство из них претерпевают деструкцию при термическом нагреве. К 1991 году был осуществлен принципиально новый подход к ионизации нелетучих соединений с сохранением их молекулярной целостности, то есть без термической деструкции больших молекул. Почти все крупнейшие фирмы научного приборостроения заинтересованы в выпуске используемых для этого метода приборов. Возросло число параметров, требующихся при создании этих приборов: точное измерение масс, ультравысокое разрешение, наличие всех методов ионизации – электроискровой, матричной лазерной десорбционной (MALDI), электрораспыление (ESI), электронного удара (EI) и химической (CI). По капиталовложениям в научное приборостроение масс-спектрометрия занимает второе место после оптических спектральных приборов, куда входят и лазеры.

1.     Общая схема метода масс-спектрометрии

Масс-спектрометрия – метод исследования и анализа вещества, основанный на ионизации атомов и молекул, входящих в состав пробы, и регистрации спектра масс образовавшихся ионов.

Идея метода проста и может быть изложена в виде следующей схемы.

1.                 Превратить нейтральные частицы – атомы или молекулы в частицы заряженные – ионы.

2.                 Разделить образовавшиеся ионы в пространстве в соответствии с их массой посредством электрического или магнитного поля.

3.                 Измеряя электрический ток, образуемый направленно движущимися ионами, можно судить об изотопном, атомарном и молекулярном составе анализируемого вещества, как на качественном, так и на количественном уровне.

2.1 Методы ионизации вещества

Существует много способов сообщить заряд нейтральной частице. В зависимости от задач исследования, а также от устойчивости частицы выбор падает на тот или иной способ ионизации. Наиболее широко применяется до настоящего времени метод электронного удара. Ионизация происходит при столкновении пучка электронов с энергией 40 – 80 эВ с молекулами исследуемого вещества. Время взаимодействия электрона с молекулой порядка   10-18 с, и в результате образуется молекулярный положительный ион, а избыточная кинетическая энергия уносится двумя электронами. Если время жизни образующегося молекулярного иона меньше 10- 6 с, то он не достигает регистрирующего устройства и отсутствует в масс-спектре. В этом случае фиксируются лишь продукты распада молекулярного иона, время жизни которых превышает 10- 6 с. Этот процесс называется фрагментацией, а продукты распада – фрагментарными или осколочными ионами.

Рассмотрим нейтральную молекулу типа АБ. При электронном ударе возможно протекание различных процессов:

АБ + ē → АБ+ + 2ē               (1)               z = +1, m = mАБ

АБ + ē → А+ + Б–               (2)               z = ±1, m1 = mА, m2 = mБ

АБ + ē → А+ + Б* + 2ē               (3)               z = +1, m = mА

АБ + ē → АБ–                             (4)               z = -1, m = mАБ

АБ + ē → АБ+ + + 3ē               (5)               z = +2, m = mАБ

Ионы имеют массу m и заряд z, и, строго говоря, разделение осуществляется не по массе, а по отношению массы иона к его заряду m / z.

Метод фотонного удара по существу аналогичен методу электронного удара, но эффективность ионизации на два-три порядка ниже. Вся избыточная кинетическая энергия уносится одним выбитым электроном, и поэтому пороговые законы, то есть зависимость интенсивности ионного тока от энергии бомбардирующих частиц, отличаются для фотонного и электронного удара. Фотонный удар оказывается существенно более точным при определении таких величин, как потенциалы ионизации. Для ионизации термически нестойких соединений использование обоих методов бесперспективно. Для ионизации труднолетучих соединений в аналитической химии применяются искровая и лазерная ионизация вещества. Ионизации подвергается твердое вещество. В искровом источнике испарение и ионизация исследуемого вещества происходят за счет искрового разряда, зажигающегося между электродами при разности потенциалов между ними от 3 до 5 кВ. На одном из электродов находится сам образец. Лазерная ионизация производится путем импульсного лазерного нагрева твердого вещества, и образующийся плазменный пучок направляется в масс-анализатор. В этих условиях происходит полное разрушение химических соединений, и в масс-спектре фиксируются лишь атомные ионы и определяется элементный состав образца. Похожие результаты можно получить производя испарение и ионизацию твердого вещества ионами или нейтральными атомами с энергией в несколько киловольт. Все эти методы хороши и широко применяются для элементного анализа.

Метод поверхностной ионизации позволяет получать ионы при термической ионизации веществ на поверхности металлов. Обычно используются металлы с высоким значением работы выхода электрона, и поверхность отбирает электрон у соединения, адсорбированного на этой поверхности.

Наиболее распространенный метод электронного удара сопровождается фрагментацией, что в большой степени связано с энергией возбуждения молекулярного иона, получаемой при электронном ударе. Поэтому появился интерес к мягкой ионизации, то есть к ионизации без фрагментации.

К методам мягкой ионизации относится химическая ионизация. При химической ионизации образование ионов происходит за счет ион-молекулярных газовых реакций. Метод хорош в тех случаях, когда исследуемое вещество А – газ. В ионизационную камеру вместе с А напускают газ-реагент R, причем давление R около 150 Па, давление А 1,5 * 10- 3 Па. Первоначально производится ионизация газа-реагента электронным ударом, затем протекают ион-молекулярные реакции вида

R+ + A = A+ + R

Большая часть образующихся ионов молекулярные и квазимолекулярные. Для пояснения термина "квазимолекулярные" рассмотрим пример с ди-n-пентиламином. В масс-спектре электронного удара основной ион имеет m / z, равное 100, и образуется путем отрыва группы С4Н9, М = 57. При химической ионизации наблюдается "квазимолекулярный" ион массой 158, который образуется за счет присоединения протона к молекуле ди-n-пентиламина, М = 157. Основным этапом ионизации является получение соединения в газовой фазе.

Другим методом мягкой ионизации является полевая десорбция. Полевая десорбция – это образование ионов в сильном электростатическом поле (108 В/см) за счет квантово-механического туннельного эффекта. Полевая десорбция может происходить при низких температурах эмиттера вплоть до 4 К и не сопровождаться диссоциацией. В результате образуются в основном молекулярные и квазимолекулярные ионы. Так, например, в масс-спектре электронного удара ацетилсалициловой кислоты преобладают продукты диссоциативной ионизации с m / z, равным 140 и 120, а в масс-спектре полевой десорбции есть только два пика: молекулярный с М = 180 и квазимолекулярный с М = 181, образованный путем присоединения протона к молекуле ацетилсалициловой кислоты. Однако, несмотря на определенные успехи, этот метод не получил достаточно широкого применения в связи с его избирательностью. Далеко не все молекулы отдают поверхности электрон при низких температурах.

К началу 80-х годов в масс-спектрометрии органических молекул возникла двоякая ситуация. Для тех молекул, которые удавалось поднять в газовую фазу, масс-спектрометрия оказалась незаменимым методом исследования. В большинстве случаев удавалось определить молекулярную массу, а процесс фрагментации был напрямую связан с наличием тех или иных функциональных групп и строением углеродного каркаса. Масс-спектр давал "отпечатки пальцев" каждого органического соединения и позволял распознать его в природных соединениях. Однако все это было справедливо только тогда, когда вещество можно было перевести в газовую фазу, минуя процесс термической деструкции самого соединения. Большинство тяжелых органических молекул оказались недоступными для исследования. К началу 80-х годов стало очевидно, что наиболее серьезное ограничение масс-спектрального метода связано с получением масс-спектров нелетучих соединений. Масс-спектрометрическим методом можно определять молекулярную массу и структуру только тех сложных органических веществ, которые легко переходят в парообразное состояние, что резко сужает перечень возможных объектов исследования. Поиск путей получения в газовой фазе молекулярных или псевдомолекулярных ионов нелетучих соединений, минуя стадию парообразования, представляется наиболее интересным этапом развития масс-спектрометрии.

Главная идея найденного решения заключалась в использовании матрицы. Оказалось, что если большая нелетучая молекула изолирована от "соотечественников" и окружена инородными телами (изолирована в "матрице"), то ее можно выбить из этого окружения без разрушения. При этом выбивание должно быть осуществлено путем импульсной подачи большой энергии так, чтобы молекула была выбита из матрицы частично в виде ионов, как положительных, так и отрицательных, и частично с захватом некоторых элементов матрицы, то есть с образованием квазимолекулярных ионов. Начало было положено методом, получившим название FAB (от англ. Fast Atom Bombardment – бомбардировка быстрыми атомами). Ионизация быстрыми атомами давно хорошо известна. Обычная схема эксперимента заключалась в том, что проводилась ионизация атомов гелия электронным ударом. Положительные ионы гелия разгоняли в электростатическом поле до энергий 5 – 10 кВ, затем ионы поступали в камеру перезарядки, наполненную гелием, и в результате перезарядки получали атомы гелия с энергией 5 – 10 кВ, которые и направляли на исследуемый твердофазный образец. В результате фиксировали лишь осколки того вещества, которое находилось на поверхности. Однако при помещении исследуемого вещества в глицериновую матрицу удалось получить спектр нелетучих органических молекул. Это был принципиальный прорыв в технике ионизации термически нестойких соединений без их деструкции. Дальнейшее развитие привело к вытеснению этого метода технически более удобным методом, получившим название MALDI (от английского Matrix Laser Desorption Ionization – матриксная лазерно-десорбционная ионизация) – лазерная десорбция в матрице. Идеальным является сочетание MALDI с времяпролетным масс-спектрометром благодаря импульсному режиму работы последнего. При этом достижимы массы до 5000 при разрешении в 5000. Использование приборов ион-циклотронного резонанса и их последней модификации, получившей название масс-спектрометрия с Фурье-преобразованием (Furier Transform Mass Spectrometry, FTMS), позволило проводить измерения в диапазоне до 30 000 а.е.м. При этом сохраняется высокое разрешения на уровне 20 000.

Серьезную конкуренцию MALDI составляет метод ионизации, получивший название "электрораспыление" (от английского Electrospray Ionization, ESI – электрораспылительная ионизация). Этот метод ионизации часто называют электродинамическим. Ионизация происходит при взаимодействии сильного электростатического поля с поверхностью жидкости на конце капиллярной трубки. В исследуемой жидкости должны быть ионы. Поэтому обычно добавляют небольшие количества ионных солей или другие соединения, которые могут привести к образованию ионов. Так, например, добавка амальгамы натрия к раствору смеси фуллеренов в органическом растворителе позволила зарегистрировать отрицательные ионы фуллеренов С60 , С70 и С70 + 2n , где n принимает значения от 1 до 12. Техника ионизации MALDI и ESI в сочетании с наиболее мощными современными масс-анализаторами позволяет успешно определять молекулярные веса таких молекул, как т-РНК (транспортная рибонуклеиновая кислота) – диапазон масс 25 000 а.е.м., ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) для последовательности в 100 нуклеотидов масса в диапазоне 31 000 а.е.м., белок альбумин – масса в районе 66 000 а.е.м. При некотором снижении разрешающей способности достижимый диапазон масс составляет несколько сот тысяч атомных единиц. Здесь уместно привести цитату из пленарной лекции на конференции в Будапеште: "ESI и MALDI позволяют получить спектры нескольких фемтомолей образца с молекулярной массой в несколько сот тысяч атомных единиц. Этот успех открывает перспективу для применения масс-спектрометрии в медицине, биологии и исследованиях окружающей среды".

1.2      Способы разделения ионов

Как способов ионизации, так и способов пространственного разделения ионов существует достаточно много.

На рис. 1 приведена схема, иллюстрирующая принцип работы так называемого магнитного масс-спектрометра, в котором ионы разделяются под действием магнитного поля, с ионизацией посредством электронного удара.

Масс-спектрометр требует создания в нем очень чистого вакуума. Давление остаточного газа в приборе обычно составляет около 10-7 – 10-10 мм рт.ст. Нейтральные молекулы исследуемого газа поступают в область камеры ионизации, где подвергаются столкновению с ионизирующими электронами. При этом часть молекул (около 0,1%) превращается в ионы по схемам, приведенным выше. Электрическое поле, образованное ускоряющей разностью потенциалов Uуск, сообщает ионам кинетическую энергию. Используя закон сохранения энергии, получим

Рис. 1 – Схема ионизации методом электронного  удара и разделения ионов по массам в магнитном масс-анализаторе

На ион, влетающий со скоростью υ в масс-анализатор, действует сила Лоренца:

Fл = qυB

В данном случае вектор магнитной индукции направлен на нас (значок ), а угол a между B и υ равен 900.

В то же время Fл является по своему характеру центростремительной силой: и, следовательно,

В результате ион с массой m и зарядом z будет двигаться в магнитном поле по дуге окружности радиуса R, определяемого из соотношения

или

Таким образом, изменяя либо Uуск , либо B, можно заставлять двигаться по окружности радиуса Rд , на линии которой находится щель входа в детектор, ионы той или другой массы или величины заряда. Записывая зависимость ионного тока от m / z, получают набор пиков, называемый масс-спектром.

Рис. 2 – Схема квадрупольного масс-анализатора

Некоторые другие способы разделения ионов по массе.

Комбинированное высокочастотное (несколько мегагерц) переменное и постоянное электрическое напряжение вида U = V + U0 cos ωt, подаваемое на систему четырех электродов (рис. 2), вынуждает ионы совершать колебательное движение в такт с частотой ω этого поля. При определенных величинах U0 , V и ω во выходную щель масс-анализатора будут проходить только ионы с определенной массой m, отвечающей условию:

m = aU0 / ω2,

где а – некоторая постоянная прибора. Все ионы с отличными массами будут двигаться с нарастающими амплитудами колебаний, что приводит к их нейтрализации на стенках электродов. Путем изменения амплитуды высокочастотного напряжения U0 или его частоты ω масс-анализатор настраивают на регистрацию ионов той или иной требуемой массы. Так работают квадрупольные масс-анализаторы. Они гораздо
компактнее магнитных и обладают довольно высокой чувствительностью.