Иммобилизованные ферменты применяемые в пищевой промышленности

Принципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимологией в результате создания нового типа биоорганических «катализаторов, так называемых иммобилизованных ферментов, т. е. ферментов, связанных с носителем. нельсон и гриффин цуже в 1916 г. Показали, что инвертаза, если адсорбировать ее на угле или на алюмогеле, сохраняет каталитическую активность. однако целенаправленная разработка такого рода гетерогенных катализаторов на основе ферментов началась лишь в 50-х гг.

Сам термин «иммобилизованные ферменты» узаконен сравнительно недавно [8]. В принципе понятие «иммобилизация» можно понимать шире, чем просто связывание фермента с водонерастворимым носителем, а именно как любое ограничение степеней свободы ферментных молекул (или их, фрагментов). Этого можно достичь даже путем внутримолекулярной «сшивки» белковых глобул низкомолекулярными бифункциональными реагентами или же присоединением фермента к водорастворимому полимеру. Однако такие препараты обычно не называют иммобилизованными; их скорее относят к ферментам, которые модифицированы соответственно «сшивающими» или полимерными реагентами.

Иммобилизованные и модифицированные ферментные препараты, обладают рядом существенных преимуществ (при использовании в прикладных целях) по сравнению с их «нативными» предшестаенниками.

во-первых, гетерогенный катализатор  легко отделить от реакционной среды, что позволяет: 1) остановить реакцию; 2) использовать катализатор повторно; 3) получать продукт, не загрязненный ферментом. последнее особенно важно в ряде пищевых или фармацевтических производств.

во-вторых, гетерогенные катализаторы позволяют проводить ферментный процесс непрерывно (например, в  проточных реакторах) и регулировать скорость катализируемой реакции (или выход продукта) скоростью потока.

в-третьих, иммобилизация или модификация  позволяют целенаправленно изменять свойства фермента, в том числе его специфичность (особенно в отношении к макромолекулярным субстратам), зависимость активности от рн-среды и, что особенно важно, его стабильность по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям среды.

Именно эти три момента лежат в основе научно-технического направления, называемого часто «инженерная энзимология». Текущая задача инженерной энзимологии — это разработка (конструирование) биоорганических катализаторов с заданными свойствами на основе ферментов (в том числе с использованием лолиферментных комплексов или даже клеток, искусственно лишенных способности расти). Говоря о «заданных» свойствах, следует понимать, что они продиктованы потребностями практики; это, например, необходимое время службы катализатора при определенных условиях реакции (что зависит от его термо- и кислотостабильности и т. п.), избирательность (специфичность) действия, производительность (каталитическая активность), иммуногенность, токсичность, геометрическая форма гетерогенного катализатора и его механические свойства и др.

Иммобилизованные ферменты обычно не раств. в воде; между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитич. р-ции, ингибиторов и активаторов.

Существует неск. осн. способов иммобилизации ферментов:

1) путем образования ковалентных связей междуферментом и матрицей;

2) полимеризацией мономера, образующего матрицу, в присут. фермента, к-рый при этом оказывается включенным в сетку полимера - обычно геля;

3) благодаря электростатич. взаимод.  противоположно заряженных групп фермента и матрицы;

4) сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу;

5) связыванием фермента и матрицы в результате невалентных взаимод. - гидрофобных, с образованием водородных связей и др.;

6) инкапсулированием - созданием  около молекул фермента полупроницаемой капсулы, напр., включением фермента в липосомы;

7) сшиванием молекул фермента между собой, напр., глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром диимида адипиновой к-ты.

8) ферменты можно адсорбировать (в результате физических или ионных взаимодействий) на керамике, стекле, силикагеле, оксидах и гидроокеидах металлов, полисахаридах, органических смолах и других носителях. для усиления адсорбции ферменты иногда химически модифицируют, вводя в поверхностный слой белковой глобулы дополнительные ионные или гидрофобные группы.

9) весьма широко применяются методы механического включения (захвата) ферментов в полимерные гели, полупроницаемые полимерные микрокапсулы, полые волокна, жидкие мембраны или липосомы, состоящие из поверхностно-активных компонентов и т. п.

 

Особый случай иммобилизации проведение ферментативных р-ций в двухфазной системе, когда фермент находится в водной фазе, а субстраты и продукты р-ции распределяются между орг. и водной фазами, что позволяет в зависимости от коэф. распределения в-в между фазами сдвигать равновесие р-ции в нужную сторону; диспергирование фаз увеличивает пов-сть их раздела и тем самым улучшает доступ субстрата к ферменту.

Среди способов иммобилизации наиб. распространение получили ковалентное связывание фермента с матрицей и включение фермента в гель. В первом случае в качестве матрицы обычно используют целлюлозу, декстрановые гели (сефароэу, агарозу), микропористые стекла или кремнеземы, а также синтетич. полимеры. Матрицу при ковалентной иммобилизации ферментов обычно предварительно активируют, обрабатывая, напр., бромцианом, азотистой к-той или цианурхлоридом. Благодаря этому она становится носителем активных группировок, к-рые способны вступать в р-цию сочетания, взаимод. с группами NH₂, ОН, СООН. Во втором случае в качестве гелеобразующего полимера используют полиакриламид.

На практике иммобилизация часто осуществляется одновременно неск. способами. Так, при фиксации ферментов ковалентными связями между их молекулами и матрицей обычно возникают также нековалентные взаимодействия. Известны способы предварит. хим. модификации молекул фермента низкомол. в-вами или р-римыми полимерами, имеющими заряженные группировки, что изменяет у таких модифицир. белков электростатич. заряд молекулы и позволяет достаточно прочно сорбировать их на ионообменных смолах.

При всех типах иммобилизации матрица, взаимодействуя с ферментом, может инактивировать последний или создавать пространств. затруднения для доступа субстрата к активному центру.

При ковалентном связывании фермента для предотвращения отрицат. влияния матрицы между ней и молекулой фермента вводят разобщающую цепь атомов - спейсер (наз. также "вставкой" или "ножкой").

Кроме того, часто стремятся использовать для иммобилизации гидрофильные матрицы, создающие вблизи фермента более естеств. микроокружение.

При иммобилизации ферментов необходимо, чтобы активные группы матрицы не блокировали каталитич. центр фермента, а условия иммобилизации не приводили к потере его активности. Определенные ограничения на способ иммобилизации налагают и особенности субстрата. Так, в случае высокомол. субстратов нельзя использовать методы инкапсулирования или включения фермента в гель. Если матрица несет на себе заряды, то заряд субстрата влияет на кинетич. параметры р-ции: разноименные заряды на носителе и субстрате увеличивают скорость р-ции, катализируемой иммобилизованными ферментами, одноименные заряды ее снижают и м. б. причиной полной потери активности препарата. Заряды носителя и субстрата влияют также на величину рН, при к-рой скорость ферментативной р-ции максимальна.Важную роль играет распределение субстрата между фазами иммобилизованного фермента и р-ра. Ограниченная доступность субстрата к активному центру фермента может привести к изменению специфичности последнего. Особенно это Характерно для высокомол. субстратов, к-рые из-за малого коэф. диффузии медленно переходят в фазу иммобилизованного фермента, что приводит к относит.увеличению скоростей др. р-ций с участием субстратов меньших размеров. В нек-рых случаях возможно также изменение направления р-ции. Так, фермент эндополигалактуроназа, катализирующий расщепление полигалактуроновой к-ты в середине молекулы, после иммобилизации отщепляет низкомол. фрагменты от концов молекулы.

Существ. влияние на кинетику р-ций, катализируемых иммобилизованными ферменами, оказывают два диффузионных барьера - внешний и внутренний. Первый обусловлен наличием тонкого неперемешиваемого слоя р-рителя вокруг частицы иммобилизованного фермента (слоя Нернста). Толщина этого слоя зависит от скорости перемешивания. Поэтому увеличение последней или скорости тока р-ра в колонке с иммобилизованным ферментом увеличивает скорость ферментативной р-ции. Внутр. диффузионный барьер возникает вследствие ограничения своб. диффузии субстрата внутри сетки полимерной матрицы.

Иммобилизация ферментов создает ряд преимуществ.

К ним относятся: более высокая  стабильность ферментных препаратов, возможность их удаления из реакц. среды  и его повторного использования, а также возможность создания непрерывных процессов на ферментных колонках.

Важное значение имеет относит. стабильность иммобилизованных ферментов к денатурирующим воздействиям - нагреванию, действию агрессивных сред, автолизу и др. Последнему подвержены протеолитич. ферменты.

 Иммобилизация разобщает молекулы этих ферментов и полностью исключает такой процесс. Благодаря этому удалось изучить механизм образования протеолитич. фермента пепсина из его предшественника пепсиногена (при этом от последнего отщепляется пептид, состоящий из 42 аминокислотных остатков). Было показано, что эта р-ция катализируется самим пепсином.Иммобилизованные ферменты применяют в произ-ве L-аминокислот, 6-аминопенициллановой к-ты, из к-рой получают полусинтетич. пенициллины, в синтезе преднизолона, для удаления лактозы из продуктов питания, используемых больными с лактазной недостаточностью, в изготовлении ферментных электродов для экспресс-определения мочевины, глюкозы и др. в-в, для создания аппаратов "искусств. почка" и "искусств. печень", для удаления эндотоксинов, образующихся в процессе заживления ран и ожогов, при лечении нек-рых онкологии, заболеваний и др.

Большое значение приобрели в клинич. и лаб. практике иммуноферментные методы анализа, в к-рых также используются иммобилизованные ферменты.

 

Применение иммобилизованных ферментов в пищевой промышленности

Использование биологических процессов и агентов для получения пищевых продуктов и улучшения их качества - древнейшая ветвь биотехнологии. Скорее, это ее корни. Примеры в этом отношении общеизвестны — получение молока, изготовление вин, уксуса, пивоварение, сыроделие, хлебопечение и т. д. во всех этих процессах в качестве биологических агентов выступали и продолжают выступать биологические организмы - от диких и домашних животных до микроорганизмов.

История пищевых технологий насчитывает тысячелетия, и тем не менее совершенствование их продолжается не только неослабевающими, но даже возрастающими темпами. масштабы современных исследований и разработок в области традиционных технологий пищевых продуктов огромны. Однако в последнее время наметились перспективы принципиального сдвига в технологиях получения и улучшения качества, пищевых продуктов: разработки в этой области стали переходить от использования целых биологических организмов на клеточный и молекулярный уровни.

Как известно, все живые организмы содержат большое количество (сотни и тысячи) ферментов, основная функция которых состоит в проведении, ускорении и регуляции практически всех химических реакций, необходимых для жизнедеятельности организма. благодаря высокой активности и специфичности некоторые ферменты уже давно нашли применение в ряде областей промышленности:

Ферменты области использования

гликозидазы

-амилаза хлебопечение

» пивоварение

» производство кондитерских изделий

» обработка текстильных изделий

» производство высококачественной бумаги

глюкоамилаза получение глюкозы

» осахаривание ликеров и пива

инвертаза производство кондитерских изделий лактаза производство мороженого пектиназы производство и осветление вин и фруктовых соков

» производство кофе

целлюлазы облагораживание растительных кормов

» приготовление морковных джемов

» обработка цитрусовых

Протеазы

протеазы микробного

происхождения размягчение мяса

» добавки к детергентам

» обработка текстильных изделий

» хлебопечение

» осветление вин и пива

» стабилизация сгущенного молока

» выделка кож 

бромелаин размягчение мяса

» стабилизация пива

папаин осветление пива

» получение белковых гидролизатов молока

» размягчение мяса

фицин размягчение мяса

трипсин выделка кож

реннин сыроделие

пепсин сыроделие

» стабилизация пива

липазы модификация вкуса молочных продуктов

» сыроделие

оксидоредуктазы производство кондитерских изделий

» выделка кож

глюкозооксидаза удаление кислорода  и/или глюкозы из пи- 
щевых продуктов

» пивоварение

» приготовление майонезов

каталаза удаление перекиси водорода после стерили- 
зации молочных продуктов, после отбелива-

ния тканей, кожи,древесины и т. д.

изомеразы

глюкозоизомераза производство глюкозо-фруктозных сиропов

В основном, как видно, это относится к пищевой промышленности, где применяются главным образом малоочищенные комплексные ферментные препараты для гидролиза природных полимеров — белков, крахмала, пектинов.

В последние полтора-два десятилетия определились пути расширения областей применения ферментов. они связаны с получением так называемых иммобилизованных ферментов, а также иммобилизованных клеток микроорганизмов. Сочетание уникальных каталитических свойств ферментов с их водонерастворимостью в иммобилизованном виде послужило основой для создания ряда новых технологических процессов. Эти процессы в настоящее время применяются главным образом в производстве пищевых продуктов.

К настоящему времени шесть процессов с использованием иммобилизованных ферментов или клеток нашли крупномасштабное применение в пищевой промышленности ряда развитых стран мира.

1. получение глюкозо-фруктозных  сиропов и далее фруктозы из  глюкозы.

2. получение оптически активных d-аминокислот из их рацемических смесей.

3. синтез l-аспарагиновой кислоты  из фумаровой кислоты.