Культивирование клеток и тканей

                        Культивирование клеток и тканей

    Культивирование клеток и тканей представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот искусственно выращиваются в контролируемых условиях. In vitro (лат. «в стекле») — это технология выполнения экспериментов, когда опыты проводятся «в пробирке» — вне живого организма.

                                              Выделение клеток

    Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов как коллагеназа, трипсин, проназа, разрушающих внеклеточный матрикс. Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей.

   Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными. Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определенного количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом не утратить жизнеспособность.

   Существуют иммортализованные («бессмертные») линии клеток, способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации, но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путем активации гена теломеразы.

                       Принципы составления питательных сред

 

       Все живые клетки нуждаются в экзогенных источниках питания, со-

держащихся в питательных  средах. Питательная среда обеспечивает

жизнедеятельность, рост и  развитие биообъектов.

   Прежде чем начинать работы по культивированию разных типов

клеток, необходимо точно  знать их питательные потребности  и зави-

симости.

     Постоянным компонентом питательных сред является вода, в кото-

рой нуждаются все живые  клетки. Питательные вещества образуют в во-

де истинные (минеральные  соли, сахара, аминокислоты, карбоновые ки-

слоты, спирты, альдегиды) или  коллоидные (белки, липиды, неорганиче-

ские соединения) растворы. Некоторые компоненты питательных  сред,

находящиеся в твердом  агрегатном состоянии, могут либо образовывать

придонный осадок, либо равномерно распределяться по всему объему в

виде взвеси, либо плавать  на поверхности раствора (частицы  угля). Жид-

кие углеводороды при внесении в воду образуют несмешивающуюся

фракцию.

     В питательной среде должны присутствовать все элементы, необхо-

димые для построения компонентов  живых клеток в доступной для  ус-

воения форме. В больших  количествах клеткам необходимы макроэле-

менты: углерод, азот, кислород, водород, фосфор, сера, калий, кальций,

магний. Снабжение клеток кислородом и водородом осуществляется за

счет воды. Углерод является составной частью всех органических соеди-

нений и его источники  многочисленны и многообразны: чаще всего са-

хара, многоатомные спирты и  органические кислоты. В качестве азоти-

стого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном

белки животного и растительного происхождения.

    Помимо макроэлементов, клетки в незначительных количествах нуж-

даются также и в  некоторых микроэлементах: натрий, марганец, никель,

кобальт, хлор, цинк, медь, кремний, молибден, бор, ванадий и некоторые

другие.

    Кроме основных пластических и энергетических компонентов, пита-

тельные среды могут содержать  и так называемые факторы роста. Это ор-

ганические соединения (витамины, аминокислоты, пуриновые и пирими-

диновые основания и др.), в которых нуждаются ауксотрофные клетки и которые они синтезировать не в состоянии. Отсутствие таких веществ при-

водит к нарушению обменных процессов и прекращению роста клеток.

    В качестве необходимых компонентов питательных сред могут вы-

ступать газы.

    Питательные среды могут иметь неопределенный состав, т. е. вклю-

чать биогенные добавки (растительного, животного или микробного

происхождения), например мясной экстракт, дрожжевой экстракт, куку-

рузную муку, морские водоросли  и т. д. Такие питательные среды  назы-

ваются натуральными. Применяют  также среды, приготовленные из чис-

то химических соединений в заранее определенных соотношениях. Это

так называемые синтетические  среды. Применение находят и полусинте-

тические питательные  среды, сочетающие в своем составе  компоненты

как натуральных, так и  синтетических сред.

    Среды данных типов имеют как преимущества, так и недостатки. С

экономической точки зрения наиболее целесообразно использование

природного, более дешевого сырья, чем веществ в чистом виде, полу-

ченных химическим путем. Однако только применение сред строго оп-

ределенного состава позволяет  точно регистрировать и регулировать

протекающие в культуральной  среде процессы, добиваясь их оптимиза-

ции. Компромиссным подходом является использование полусинтетиче-

ских сред, в состав которых  наряду с соединениями известной  химиче-

ской природы входят биогенные  добавки.

                 Устройства для приготовления питательных сред

       Одним из главных требований к жидким питательным средам для

клеточных культур является их стерильность, достигаемая в ряде случаев

 так называемой стерилизующей  фильтрацией, освобождающей пита-

тельные среды от примесных  частиц, бактерий и коллоидов.

Следует различать микро- и ультрафильтрацию сред. При микро-

фильтрации из жидкости удаляются  частицы примесей и бактерий раз-

мерами от 0,25 до 10 мкм. Ультрафильтрация приводит к извлечению из

раствора очень мелких частиц и коллоидов, а также молекул  растворен-

ных веществ с молекулярными  массами от 1 тыс. до 1 млн.

         Процесс микрофильтрации осуществляется пропусканием жидкости

через мембранные или глубинные  фильтры. Ряд недостатков, свойствен-

ных глубинным фильтрам, изготавливаемым  из ваты, стекловолокна, ас-

беста, фарфора и других материалов (например, возможность  роста мик-

роорганизмов в массе  фильтра, поглощение значительных количеств

фильтруемых жидкостей), делают предпочтительным использование при

очистке питательных сред мембранных фильтров, которые имеют  поры

гарантированного размера  и лишены перечисленных выше недостатков.

Мембранные фильтры изготавливаются  из различных полимеров, в том

числе позволяющих стерилизацию (фторопласт, поливинилдендифторид,

эфиры целлюлозы) и обеспечивающих химическую стойкость к компо-

нентам питательных сред. Для стерилизующей фильтрации питательных

сред чаще всего используются мембранные фильтры диаметром

0,2−0,22 мкм. 

      В общем случае установка для стерилизующей фильтрации состоит

из системы создания избыточного  давления на фильтруемую жидкость,

стерильного держателя фильтра, фильтрующей мембраны, трубопрово-

дов и сосудов для размещения фильтруемой жидкости и фильтрата.

Для обеспечения движения жидкости через фильтр к ней необходимо

приложить определенное давление извне. Подобное давление может

быть создано центробежными  силами, вакуумом на выходе установки,

но чаще для этой цели используется подача нейтрального газа (напри-

мер, азота) под определенным давлением в сосуд со средой, подлежащей

очистке. Величина избыточного  давления зависит от размера пор  и пло-

щади мембраны.

Массовое культивирование  клеток является основой для промышленного  производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии.