Методы молекулярной биологии

МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

Молекулярная биология использует широкий арсенал биологических, физических и химических методов, одни из которых достались ей «в наследство» от наук-предшественниц (биохимии, цитологии, генетики и др.), а другие были созданы в процессе ее собственного развития специально для работы с молекулярными объектами. Ниже приведен перечень ряда наиболее широко используемых методов и отмечены области их применения.

Микроскопия — имеет давнюю историю, начиная с XVII в., когда в 1611 г. Й. Кеплер предложил принцип создания светового микроскопа, а А.Левенгук впервые наблюдал с его помощью одноклеточные бактерии (1638). Именно световая микроскопия, имеющая предел разрешения 0,4—0,7 мкм, позволила М. Шлейдену и Т. Швану в 1838 г. создать клеточную теорию, согласно которой клетка, содержащая ядро, является структурной и функциональной единицей строения всех животных и растений. Затем Р.А. Колликер впервые в 1857 г. описал митохондрии, а В.Флемминг — поведение хромосом при митозе.

В развитии микроскопии существенными вехами стали изобретения интерференционного (1930), фазово-контрастного (1932) и, наконец, электронного микроскопов (1939).

Электронная микроскопия, позволяющая обычно различать объекты размером около 20 А (2 нм) и имеющая в наиболее современных моделях электронных микроскопов предел разрешения до 0,1 нм, нашла самое широкое применение для изучения структур вирусов, внутриклеточных органелл, белково-нуклеино-вых комплексов (хроматин, рибосомы, информосомы) и отдельных белковых молекул. Один из вариантов этого метода — крио-электронная микроскопия — является в настоящее время ведущим при изучении тонкой структуры рибосом.

Наиболее впечатляющие и информативные трехмерные (объемные) изображения клеточных структур позволяют получить сканирующие электронные микроскопы (рис. 1).

Рентгеноструктурный анализ — основан на дифракции рентгеновских лучей (электромагнитного излучения с длиной волны около 10~10м); позволяет выявить трехмерное расположение атомов в молекулах (разрешение составляет менее 0,1 нм).

5 мкм

Рис. 1. Примеры изображений, получаемых методом электронной микроскопии:

А — электронная микрофотография фаговых частиц (х200 000). Слева направо: фаг (рХ174, имеющий форму икосаэдра, вирус табачной мозаики {палочкообразная частица) и фаг Т4; Б — полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа фотография полиморфноядерного лейкоцита, поглощающего посредством фагоцитоза дрожжевую клетку

Метод был разработан в Англии Г. Брэггом и Л. Брэггом, и именно с его помощью были получены основополагающие сведения о структуре молекул белков, ДНК и РНК.

В наше время этот метод в сочетании с компьютерным анализом полученных данных является ведущим для изучения трехмерной структуры биополимеров.

Радиоактивные изотопы — широко используются для изучения нуклеиновых кислот, белков, углеводов и других молекул в живой клетке. Радиоизотопы нестабильны и подвергаются спонтанному распаду, при котором либо высвобождаются заряженные частицы — электроны, либо происходит гамма-излучение. Период полураспада варьирует от короткого, как, например, у изотопа 32Р (14 сут), до очень протяженного, как у 14С (5570 лет). Электроны определяют по ионизации газа в сцинцилляционном счетчике или счетчике Гейгера, либо методом радиоавтографии (по их воздействию на серебро, содержащееся в чувствительном фотоэмульсионном слое).

Радиоактивные молекулы используются при изучении самых разнообразных внутриклеточных процессов: синтеза молекул из их предшественников, определения внутриклеточной локализации молекул, времени их функционирования в клетке и ее отдельных компартментах, химических превращениях в отдельных участках макромолекул и т.д. Если, например, инкубировать клетки с радиоактивным предшественником РНК (3Н-уридином), то можно определить, что РНК синтезируется в ядре, а затем переходит в цитоплазму клеток. Радиоактивную метку можно вводить в изучаемые молекулы с помощью ферментов. Так, с использованием фосфотрансфераз и нуклеотидилтрансфераз можно вводить метку в белки, углеводы и нуклеиновые кислоты, используя для этого различные радиоактивные формы АТР.

Ультрацентрифугирование (седиментационный анализ) — получило широкое распространение после изобретения в 1926 г. Т. Сведбергом аналитической ультрацентрифуги, с помощью которой он впервые определил молекулярную массу гемоглобина (68 кДа). В этом методе скорость седиментации (осаждения) определяется размером и формой разделяемых компонентов и выражается коэффициентом седиментации S. Коэффициент седиментации измеряется в секундах и определяется по формуле: {dx/di)/^x, где х — расстояние от центра вращения (радиус ротора центрифуги (см), определяемый от оси вращения до дна центрифужной пробирки); dx/dt — скорость седиментации (см/с); w — угловая скорость вращения ротора (рад/с). Коэффициенты седиментации обычно представляют собой очень малые значения и поэтому выражаются в единицах Сведберга (S): IS = 1 ■ 10м3 с. Коэффициент седиментации молекулы гемоглобина составляет 4,5S, молекулы тРНК — 4S, рибосомы кишечной палочки — 70S, лизосомы — 9400S.

В 40 — 50-е годы XX в. А.Клод и Ж.Браше разработали метод дифференциального центрифугирования для разделения органелл клетки, с помощью которого де Дюв (de Duve) в 1953 г. впервые выделил лизосомы, а затем — пероксисомы. В 1957 г. М.Месельсон, У. Сталь и Дж. Виноград разработали метод центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия для разделения нуклеиновых кислот, с помощью которого было установлено, что репликация ДНК осуществляется полуконсервативным путем. Различные варианты метода ультрацентрифугирования широко используют в молекулярно-биологических исследованиях для выделения внутриклеточных компонентов и макромолекул (нуклеиновых кислот и белков), а также определения их молекулярных масс и коэффициентов седиментации.

Для более тонкого фракционирования и очистки разнообразных молекул и прежде всего белков в настоящее время применяется большая группа разнообразных физико-химических методов. Рассмотрим только наиболее широко распространенные методы фракционирования белков: хроматографию, электрофорез и изоэлектрофокусирование. Методы исследования структуры и функций нуклеиновых кислот изложены в последующих главах.

Хроматография — метод, впервые изобретенный русским ученым М. С. Цветом, который в 1906 г. фракционировал окрашенные экстракты листьев растений на колонках с порошком мела.

В настоящее время существует большое количество вариантов хроматографии, в которых используют матриксы (носители) разных типов, позволяющие разделить белки по заряду (ионообменная хроматография), размеру молекул (гель-хроматография, чаще называемая гель-фильтрацией) или способности специфически взаимодействовать с определенными химическими группами веществ, предварительно связанных с матриксом (аффинная хроматография). Из всех вариантов хроматографии наибольшей эффективностью обладает аффинная хроматография (хроматография по сродству), в основе которой лежит специфическое взаимодей ствие (узнавание) молекул взаимодействующих веществ. Например, предварительно связав с матриксом субстрат фермента, можно добиться избирательного удерживания фермента на колонке, а затем после выхода остальных («балластных») белков элюировать его в практически гомогенном состоянии. Матрикс можно оснастить и специфическими антителами и использовать такой носитель для выделения белков, распознаваемых этими антителами. Связав с матриксом фрагменты ДНК, можно выделить белки, специфически связываемые с определенными участками хромосом.

Широкое распространение получила также высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC). В этом методе используются специально разработанные кремнийорганические смолы, способные образовывать гомогенную среду в форме микросфер диаметром 3—10 мкм и позволяющие при высоком давлении осуществить быстрое равномерное протекание растворителя через колонку, при котором весь процесс хроматографии занимает считанные минуты и обеспечивает тонкое фракционирование смеси анализируемых молекул.

Электрофорез — в основе этого метода лежит способность белков, обладающих определенным суммарным положительным или отрицательным зарядом, перемещаться в электрическом поле в соответствии с величиной заряда, размером и формой молекул. Электрофорез можно проводить в водном (буферном) растворе, однако, как правило, его проводят в каком-либо пористом (полимерном) носителе: крахмальном, агарозном или полиакрил амид-ном геле, на целлюлозных или нитроцеллюлозных пластинах и т.д.

Простейший метод электрофореза на пластинах целлюлозы был использован В.Ингрэмом в 1956 г. при фракционировании фрагментов протеолитического расщепления гемоглобина человека, полученных в результате обработки этого белка трипсином. С помощью данного метода были получены пептидные карты — «фин-герпринты» (отпечатки пальцев), по которым было установлено, что заболевание серповидноклеточной анемией обусловлено заменой одной-единственной аминокислоты в р-цепи гемоглобина.

Наиболее часто в настоящее время для разделения белков используют метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), который представляет собой инертный матрикс с высоким и контролируемым числом поперечных сшивок. Варьируя размеры ге-левых пор, можно фракционировать белки, существенно отличающиеся по молекулярной массе (от нескольких десятков тысяч до сотен тысяч дальтон). Метод был разработан в 1959 г. С. Рэймон-дом, а затем усовершенствован Б.Дэвисом и Л. Орнстейном. Он позволяет осуществить тонкое фракционирование смесей белков, отличающихся по заряду и молекулярной массе. Дальнейшей модификацией этого метода стал электрофорез в ПААГ с додецилсуль-фатом натрия, предложенный в 1966 г. Дж.Майзелем. Додецилсульфат натрия (ДСН, SDS, ДС-Na) представляет собой мощный ионный детергент, который вызывает разворачивание белковых молекул в вытянутые цепи и сообщает им избыточный отрицательный заряд. Потерявшие нативную форму белки в таком (денатурирующем) геле перемещаются к положительно заряженному электроду (аноду) со скоростью, которая детерминируется только размером (массой) их полипептидных цепей. При этом гель, выступая в роли молекулярного сита, легче пропускает некрупные полипептиды и в большей мере тормозит продвижение более крупных молекул, тем самым разделяя белки в соответствии с их молекулярными массами. При электрофорезе с SDS обычно используют также обработку белков 3-меркапто-этанолом, разрывающим (восстанавливающим) дисульфидные связи между субъединицами белков, что позволяет определить число и массу субъединиц в белках-мультимерах. После электрофореза белки выявляют либо красителем Кумасси, либо серебрением (минорные белки), что позволяет выявить на электрофоре-граммах ничтожные количества (около 10 нг) белка.

В начале 70-х годов XX в. в Швеции был разработан новый метод разделения белков в электрическом поле, получивший название изоэлектрофокусмрования. В отличие от метода электрофореза, в процессе которого белки фракционируют при каком-то определенном значении рН, задаваемом электрофоретическим буферным раствором, при изоэлектрофокусировании белки разделяют в градиенте рН, создаваемом с помощью специальных реагентов (амфолинов). В процессе изоэлектрофокусирования белки передвигаются в электрическом поле в строгом соответствии только с зарядом молекул и останавливаются (фокусируются) в тех точках градиента рН, которые соответствуют их изоэлектрическим точкам (рГ), т.е. там, где молекулы становятся электронейтральными. Изоэлектрофокусирование позволяет не только исключительно тонко разделить белки по заряду (разделяются белки, отличающиеся пор/всего на 0,005 единиц рН), но и быстро и точно определить их изоэлектрические точки.

Разработанное в 1975 г. П.Офареллом сочетание методов изоэлектрофокусирования и электрофореза в ПААГ с SDS получило название двумерного электрофореза.

Культура клеток – этот метод берет начало в 1885 г., когда впервые было обнаружено, что клетки куриного эмбриона сохраняют жизнеспособность в солевом растворе. С 1907 г. начали использовать культуры фрагментов тканей – эксплантантов. В настоящее время используют диссоциированные культуры клеток, из которых можно получить клетки одного типа. Клеточные линии служат источником большого количества клеток одного типа и к тому же могут храниться при -70 °С неопределенно долго, не теряя способности к пролиферации. Наиболее часто используются клеточные линии фибробластов мышей и хомячков, а также эпителиальные клетки человека. В 1952 г. была получена перевиваемая до сих пор линия клеток карциномы шейки матки человека, широко известная как линия HeLa.

Однородность клеточных линий можно повысить путем клонирования. Клон — это популяция клеток, происходящая от одной клетки-предшественницы. С помощью клонирования выделяют мутантные клеточные линии, у которых мутация затронула определенные гены. Такие клетки бывают нередко дефектны по какому-то определенному белку, что позволяет проанализировать его функцию в нормальных клетках.

Слиянием двух клеток могут быть получены гетерокарионы — клетки с двумя отдельными ядрами. После митотического деления гетерокарион превращается в гибридную клетку, у которой все хромосомы объединяются в одном ядре. Такие гибридные клетки дают возможность изучать функции отдельных хромосом, взаимодействие внутриклеточных компонентов (митохондрий, ядер и др.) различных клеток. Их можно клонировать и получить гибридную клеточную линию. Существенно, что гибридные клетки нестабильны. В частности, гибридные клетки человек-мышь постепенно утрачивают хромосомы человека, что позволяет судить о функциях отдельных хромосом, осуществляя таким образом их генетическое картирование.

Бесклеточные системы — незаменимы для изучения механизмов определенных молекулярных процессов, так как исключают различные побочные реакции, протекающие в клетке. В 1954 г. П. Замечник получил первую бесклеточную систему для изучения биосинтеза белка (трансляции). Возможности этих систем были далее блестяще использованы А. С. Спириным, М. Номурой и другими исследователями для изучения деталей трансляции. При этом из экстрактов клеток выделяли важнейшие компоненты белок-синтезирующей системы (мРНК, рибосомы, тРНК и др.), а затем последовательно вводили их в систему и уточняли роль каждого компонента в биосинтезе белка. С помощью бесклеточных систем был расшифрован генетический код, для чего в качестве мРНК использовали синтетические олиго- и полинуклеотиды известного состава. Бесклеточные системы используются также для изучения деталей других важнейших молекулярно-генетических процессов: репликации и транскрипции ДНК, сплайсинга РНК и др.