Автор работы: Пользователь скрыл имя, 17 Февраля 2013 в 15:48, реферат
Генная инженерия - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Иными словами, набор специальных методов для создания генно-инженерных конструкций.
Введение
Генная инженерия - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Иными словами, набор специальных методов для создания генно-инженерных конструкций.
Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология. Уже сегодня генная инженерия позволяет включать и выключать отдельные гены, контролируя, таким образом, деятельность организмов, а также - переносить генетические инструкции из одного организма в другой, в том числе - организмы другого вида. По мере того, как генетики всё больше узнают о работе генов и белков, всё более реальной становится возможность произвольным образом программировать генотип (прежде всего, человеческий).
Перенос генов дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим. Цель генной инженерии – создание рекомбинантных ДНК, которые состоят из фрагментов молекул ДНК, полученных от разных организмов.
Генная инженерия является основой:
1.Основные этапы создания и клонирования рекомбинантных ДНК.
Рекомбинантные ДНК состоят из фрагментов ДНК, полученных от разных организмов (например, ДНК бактерии, вируса и человека).
В 1973-74 гг. С. Коэном, Д. Хелинским, Г. Бойером и другими учеными впервые сконструированы функционально активные молекулы гибридной ДНК, то есть удалось их клонирование. Были созданы первые, не существующие в Природе, плазмиды (стабилизатор наследства) на базе ДНК из разных видов бактерий и высших организмов, из ДНК лягушки (кодирующей синтез рРНК), морского ежа (контролирующей синтез белков-гистонов), и от мыши. Первые рекомбинантные ДНК называли химерами.
Достижения генетики и химии нуклеиновых кислот позволили разработать методологию генной инженерии. Методы генной инженерии используют в определенной последовательности, причем различают несколько стадий в выполнении типичного генно-инженерного эксперимента, направленного на клонирование какого-либо гена, а именно:
1. Выделение ДНК из клеток интересующего организма (исходного) и выделение ДНК-вектора.
2. Разрезание (рестрикция) ДНК исходного организма на фрагменты, содержащие интересующие гены, с помощью одного из ферментов-рестриктаз и выделение этих генов из образованной рестрикционной смеси. Одновременно разрезают (рестрикциируют) векторную ДНК, превращая ее из кольцевой структуры в линейную.
3. Смыкание интересующего сегмента ДНК (гена) с ДНК вектора с целью получения гибридных молекул ДНК.
4. Введение гибридных молекул ДНК путем трансформации в какой-либо другой организм, например, в Е. coli или в соматические клетки.
5. Высев бактерий, в которые вводили гибридные молекулы ДНК, на питательные среды, позволяющие рост только клеток, содержащих гибридные молекулы ДНК.
6. Идентификация колоний, состоящих из бактерий, содержащих гибридные молекулы ДНК.
7. Выделение клонированной ДНК (клонированных генов) и ее характеристика, включая секвенирование азотистых оснований в клонированном фрагменте ДНК.
Создание рекомбинантной ДНК осуществляется по принципу «вектор-вставка», где вставка- это чужеродная ДНК, встроенная в вектор, а вектор- это молекула ДНК, которую используют для переноса рекомбинантной ДНК в клетку- хозяина с целью её размножения и клонирования.
Для вставки используют:
Сегмент ДНК (ген), который предназначен для молекулярного клонирования, должен обладать способностью к репликации при переносе его в бактериальную клетку, т. е. быть репликоном. Однако он такой способностью не обладает. Поэтому, чтобы обеспечить перенос и обнаружение клонируемых генов в клетках, их объединяют с так называемыми генетическими векторами. Последние должны обладать, как минимум, двумя свойствами.
Во-первых, векторы должны быть способны к репликации в клетках, причем в нескольких копиях.
Во-вторых, они должны обеспечивать возможность селекции клеток, содержащих вектор, т. е. обладать маркером для отбора и клонирования трансформированных клеток хозяина.
Таким требованиям отвечают плазмиды и фаги. Плазмиды являются хорошими векторами по той причине, что они являются репликонами и могут содержать гены резистентности к какому-либо антибиотику, что позволяет вести селекцию бактерий на устойчивость к этому антибиотику и, следовательно, легкое обнаружение рекомбинантных молекул ДНК.
Поскольку природные плазмидные векторы неизвестны, то все известные к настоящему времени плазмидные векторы были сконструированы искусственно. Исходным материалом для создания ряда генетических векторов послужили R-плазмиды, в которых с помощью рестриктаз удаляли излишние последовательности ДНК, в том числе те, на которых располагались множественные сайты рестрикции. Это удаление определялось тем, что плазмидный вектор должен обладать только одним сайтом узнавания для одной рестриктазы, причем этот сайт должен лежать в функционально несущественном районе плазмидного генома. Например, плазмидный вектор pBR 322, который содержит гены резистентности к ампициллину и тетрациклину, что делает его очень удобным для селекции бактерий, содержащих клонируемый сегмент ДНК, обладает одиночными сайтами рестрикции для более 20 ферментов-рестриктаз, включая такие известные рестриктазы, как Eco R I, Hind III, Pst I, Pva II и Sal I
Фаговые векторы тоже обладают рядом преимуществ. Они могут включать в себя более крупные (более длинные) клонируемые фрагменты ДНК по сравнению с плазмидными векторами. Далее, перенос фагами клонируемого фрагмента в клетки в результате инфицирования ими последних является более эффективным, чем трансформация ДНК. Наконец, фаговые векторы позволяют более эффективный скрининг (распознавание) на поверхности агара колоний, содержащих клетки, несущие клонируемый ген. Многие фаговые векторы сконструированы на базе фага λ (так называемые косплазмиды – плазмиды, которые содержат cos – сайты фага λ).
Кроме фаговых используют и другие вирусные векторы, сконструированные на базе вируса герпеса, а также векторы, сконструированные на базе дрожжевой ДНК (с использованием Yac – yeast artificial chromosomes – искусственные хромосомы дрожжей).
2. Основные ферменты, используемые в генной инженерии.
3. Строение плазмидного вектора.
Карта плазмиды pBR 322
4. Схема создания рекомбинантной ДНК.
5. Трансформация. Скрининг.
Трансформация – изменение свойств клетки в результате переноса рекомбинантной ДНК через мембрану.
Как уже отмечалось, выделение (получение) нужного гена (трансгена), намеченного для переноса – один из главных этапов в генетической инженерии. Ген может быть выделен из естественных источников (из подходящего генома), синтезирован химическим (по имеющейся последовательности нуклеотидов) или ферментативным путем с использованием механизма обратной транскрипции (синтез кДНК на матрице мРНК с помощью обратной транскриптазы), получен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Часто нужный ген выделяют из банка генов.
Банк генов, или клонотека (геномная библиотека) – это коллекция
клонов ДНК, включающая все фрагменты, входящие в состав генома данного вида. Для ее создания необходимо выделение всей (тотальной) геномной ДНК, ее фрагментация с помощью рестриктаз или методом дробовика(ультразвуком); присоединение полученных фрагментов к клонирующим векторным молекулам, введение рекомбинантных ДНК в реципиентные бактерии для их последующего клонирования. В результате получают клоны с разными фрагментами одной молекулы ДНК. Набор клонированных фрагментов генома и называется банком генов, а точнее, – это произвольная (случайная) коллекция клонированных фрагментов ДНК, представляющая собой совокупность всех нуклеотидных последовательностей ДНК данного индивида или вида. Однажды полученная библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго. В библиотеке содержится вся наследственная информация организма. Банк генов – это не только источник для получения нужного трансгена, но и источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функции белков. С его помощью можно также решить проблему сохранения генофонда исчезающих видов.
Гены эукариот занимают достаточно протяженные участки ДНК (до 2,5 млн пн). Для клонирования таких крупных фрагментов плазмидные векторы не подходят. В этом случае используют клонирующие векторы, созданные на основе бактериофага λ (возможный размер клонируемого фрагмента – до 23 тпн), космиды (до 45 тпн) или же искусственные хромосомы (от 100 до >1000 тпн).
Первую геномную библиотеку создали Т. Маниатис с сотрудниками в
1978 г. Они использовали ДНК из генома D. melanogaster, которую клонировали в клетках E. coli. Аналогичные коллекции, полученные из индивидуальных хромосом или их частей, называются хромосомными библиотеками.
Библиотеки кДНК составляют копии ДНК, комплементарные РНК. Поскольку кДНК получают из зрелых мРНК, прошедших процессинг, они не содержат интронов. Библиотека кДНК отражает спектр генной активности в клетках, из которых она была выделена. Создание таких библиотек полезно для сравнения генной активности в клетках разных тканей.
Скрининг - поиск и обнаружение рекомбинантных ДНК среди десятков тысяч клонов. (Клон – популяция клеток, которая берёт начало от одной клетки).
Поиск нужных генов в смеси клонированных фрагментов ДНК библиотеки осуществляется различными способами; суть всех их состоит в скринировании библиотек. Рассмотрим некоторые из них.
1. Если нам доступен искомый ген, мы знаем его местоположение,
молекулярную массу, то его можно выделить путем разделения фрагментов по молекулярной массе и заряду при помощи гель-электрофореза. Для этого исследуемые образцы (содержащие различные фрагменты одной и той же ДНК) наносят сверху на агарозный или полиакриламидный (ПААГ) гель. При наложении на гель электрического поля фрагменты начнут перемещаться вниз (от отрицательного к положительному полюсу, поскольку молекулы ДНК отрицательно заряжены) со скоростью, зависящей от длины (массы) фрагмента. Это связано с тем, что в гелевой среде, состоящей из пор, молекулы ДНК разного размера тратят разное время на преодоление пор. Чем меньше размер фрагментов, тем быстрее они движутся. В результате электрофореза в геле образуется ряд полос, расположенных одна под другой. Верхние полосы соответствуют фрагментам, имеющим более крупные размеры, а нижние – более мелкие. Полосы выявляются при окрашивании гелей бромистым этидием и просмотре гелей в ультрафиолетовом свете. Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез маркерных молекул с известными молекулярными массами. Зная, какую массу имеет фрагмент, содержащий интересующий нас ген, можно выделить его из электрофоретического геля и использовать по назначению.
2. Если единственным «паспортом» искомого гена служит его нуклеотидная последовательность, то поиск нужного гена в смеси фрагментов ДНК осуществляют с помощью метода гибридизации нуклеиновых кислот (так называемой in situ – гибридизации). Для этого применяют молекулярные зонды. Зонды – это искусственно синтезированные меченые (изотопами или флуоресцентными красителями – химически) небольшие (10–30 нуклеотидов) сегменты одноцепочечной ДНК (или РНК, или ее ДНК-копии), комплементарные искомому гену. Зонд – это синтетический олигонуклеотид (короткий сегмент одноцепочечной ДНК) с известной нуклеотидной последовательностью, который используется для выявления комплементарных последовательностей с помощью гибридизации (т.е. зонды служат индикаторами гомологии при гибридизации соответствующих по следовательностей).
Для успеха работ по генетической инженерии важно, чтобы каждый