Лабораторная диагностика сифилиса

Лабораторная диагностика сифилиса

В последнее десятилетие в лабораторной диагностике сифилиса произошли значительные изменения. Такие классические тесты, как реакция связывания комплемента (реакция Вассермана), реакция Кана, цитохолевая и другие реакции преципитации утратили свою актуальность вследствие недостаточной чувствительности и большого количества неспецифических результатов. Вместо них используются во много раз более чувствительные и специфичные тесты. Внедрены молекулярно-биологические ДНК- и РНК-тесты. При интерпретации результатов тестирования используется компьютерный анализ, что исключает их субъективную оценку. Тестирование автоматизировано, методы стандартизированы, разработаны и сертифицированы различные диагностические комплексы. Это открывает широкие возможности для диагностики сложнейших случаев заболевания. В диагностике сифилиса используются: 
1. Бактериоскопия. 
2. Методы серологического исследования (неспецифические и специфические). 
3. Исследование спинномозговой жидкости (СМЖ). 
4. Гистологическое исследование - преимущественно в стадии третичного сифилиса. 
5. Бактериоскопическое исследование. 
6. Микроскопическое исследование нативного препарата отделяемого эрозивных или язвенных высыпаний или пунктата из лимфоузла для выявления Treponema pallidum.

Бактериоскопический метод

Получение материала и подготовка к исследованию 
Материал со слизистых оболочек, кожи половых органов или экстрагенитальной области с подозрительными эрозивными или язвенными дефектами, непосредственно с поверхности твердого шанкра, широкой кондиломы, эрозивных папул получает врач лаборатории или любой другой врач в помещении, где подготовлен микроскоп с темным полем зрения. Поверхность ulcus durum или эрозивных папул протирается тампоном, смоченным в физиологическом растворе, и затем раздражается бактериологической платиновой или вольфрамовой петлей несколько минут, пока из глубоких слоев не покажется прозрачная тканевая жидкость. Необходимо следить, чтобы к ней не примешивалась кровь, в противном случае это затруднит исследование. Полученная жидкость переносится петлей на предметное стекло, куда при необходимости можно добавить физиологический раствор. Подготовленный препарат исследуется в темном поле микроскопа. Если результат негативный, исследование повторяется несколько дней подряд, а в промежутках между исследованиями применяются аппликации с физиологическим раствором. 
Перед микроскопическим исследованием нельзя использовать антибиотики и местные антисептические средства! 
Исследование 
Полученный материал с каплей физиологического раствора, помещенный на предметное стекло и накрытый покровным стеклом, исследуется под микроскопом с помощью объектива с 40-кратным увеличением и окуляра с 10-кратным увеличением. Для микроскопического подтверждения диагноза необходимо обнаружить, по крайней мере, 2-3 морфологически типичные, живые трепонемы с характерными движениями. Отрицательный результат не исключает вероятность заболевания сифилисом, поэтому исследование необходимо повторить несколько раз. Употребление пациентом антибиотиков или местных антисептических средств является важным моментом в анамнезе. 
Клиническое значение 
Диагноз первичного серонегативного сифилиса может быть подтвержден только при наличии бледных трепонем. У пациентов с приобретенным или с врожденным сифилисом трепонемы обнаруживаются во всех сифилидах как раннего, так и позднего сифилиса. Интенсивность тканевой реакции обратно пропорциональна количеству этих микроорганизмов, наибольшее количество которых находится в первичной сифиломе (твердый шанкр), в региональных лимфоузлах и папулах вторичного свежего сифилиса, а наименьшее - в поздних сифилидах. У пациентов с вторичным сифилисом бледные трепонемы могут обнаруживаться во всех органах. 
В циркулирующей крови трепонемы могут присутствовать кратковременно только у пациентов с вторичным свежим сифилисом и ранним врожденным сифилисом. Кровь является неблагоприятной средой для трепонем, которую они быстро покидают, мигрируя в ткани. Чрезвычайно трудно обнаружить трепонемы в цереброспинальной жидкости даже у пациентов с tabes dorsalis и прогрессивным параличом. Сперма человека является инфекционной. Моча, пот, слюна не являются контагиозными, если они не соприкасаются с мокнущими высыпаниями. Напротив, в молоке матери трепонемы обнаруживаются. У больных сифилисом трепонемы можно выявить в пунктате лимфоузлов, в селезенке и в неспецифических повреждениях (в экссудате полостных элементов различного происхождения, например, в пузырьках herpes simplex). Метод характеризуется низкой себестоимостью, ответ можно получить в течение получаса. 
Возможные ошибки 
Для быстрой диагностики сифилиса важно, чтобы больной не занимался самолечением. Если поверхность шанкра, кондиломы или эрозивной папулы покрыта корочкой, образовавшейся в результате вторичного инфицирования, ее следует очистить с помощью физраствора. 
Раздражение поверхности элемента с целью получения тканевой жидкости необходимо выполнять очень осторожно, чтобы не вызвать кровотечение, поскольку наличие эритроцитов в микропрепарате затрудняет качественную диагностику. Исследование считается положительным только при обнаружении морфологически типичных трепонем с наличием, по крайней мере, 8 завитков и характерными движениями. Treponema pallidum необходимо дифференцировать с Т. refringens, Т. balantidis, Т. phagadenis, Т. gracilis, Т. macrodentinum, T.microdentinim.

Серодиагностика сифилиса

В выявлении и подтверждении диагноза сифилиса, особенно в случае поздних и латентных форм заболевания, когда клинические проявления ничтожны или отсутствуют, решающее значение отдается серологическим методам диагностики. Отмечены случаи, когда о заболевании сифилисом свидетельствуют только полученные специфические положительные результаты тестирования при исследовании сыворотки или плазмы.

Неспецифические (нетрепонемные) тесты

К неспецифическим (нетрепонемным) тестам, являющимся методами экспресс-диагностики сифилиса, относятся RPR (Rapid Plasma Reagins), тест с инактивированной сывороткой - МРП (микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном) и их модификации. Это так называемые флокуляционные тесты, где сформировавшийся в ходе реакции комплекс «антиген + антитело» образует хлопья, которые различимы при помощи лупы. Во всех указанных тестах в качестве антигена используется кардиолипиновый антиген, полученный из сердечной мышцы быка и не имеющий никакой связи с антигенами возбудителя сифилиса Treponema pallidum. 
В диагностике сифилиса нетрепонемные тесты используются в качестве скрининговых (отборочных) и не подходят для подтверждения диагноза сифилиса. Такие тесты применяются для обследования больших групп населения во время профилактических осмотров или в эпидемиологически неблагоприятной ситуации. Тесты достаточно чувствительны, технически просты, однако требуют специально обученного персонала. Результаты тестирования должен оценивать и подтверждать врач. Для экспресс-диагностики используются преимущественно серологические тесты МРП и RPR. Чувствительность нетрепонемных тестов при ранних формах сифилиса составляет приблизительно 70%, в случае вторичного сифилиса - 100%, при латентных формах - 30%. Неспецифические тесты могут давать ложноположительные результаты в 2-2,8% случаев. У отдельных категорий пациентов, например, у беременных, это число может увеличиваться до 3-3,5%. МРП и RPR становятся позитивными через 1 -4 недели после появления шанкра, то есть через 1-1,5 месяца после инфицирования. Примерно в 2% случаев наблюдается так называемый феномен «прозоны», когда на фоне выраженной клинической картины сифилиса и положительных результатов специфических серологических реакций RPR могут не давать положительных результатов. В таких случаях положительный результат получают, разбавив образец сыворотки. При обследовании беременных, доноров, пациентов отоларингологического, неврологического и психоневрологического отделений, нетрепонемные тесты обязательно применяются в комплексе со специфическим диагностическим тестом (РПГА, ИФА). 
Количественные методы (определение титра антител) МРП и RPR используются для контроля эффективности лечения. 
Принцип МРП 
При соединении эмульсии кардиолипинового антигена с плазмой или сывороткой больного сифилисом образуется флокулят (комплекс «антиген + антитело»), который выглядит как белые снежинки. У каждой из тест-систем (МРП, RPR) имеются свои технические особенности, однако принцип метода одинаков. 
Исследуемый материал Плазма или сыворотка, используемые для анализа, должны быть прозрачными. Для тестирования не подходит хилезный или гемолизированный материал. 
- Получение плазмы из капиллярной крови: кровь из пальца берут аналогично методике 
определения СОЭ. В пипетку Панченко набирается 5% раствор цитрата натрия до отметки «К», а затем выливается обратно в бутылочку до отметки на пипетке «25». Оставшийся цитрат натрия сливается в пробирку для центрифуги, куда добавляют три пипетки крови из пальца пациента, набранной до отметки «К», и перемешивают. Кровь оставляют при комнатной температуре до разделения плазмы и эритроцитов. Чтобы ускорить процесс, кровь можно центрифугировать. Полученную плазму забирают пипеткой Пастера или специальной пипеткой и используют для диагностики. Для получения плазмы рекомендуется применять специальные микроветы. Материал необходимо доставить в лабораторию в течение 4-6 часов. 
- Получение инактивированной сыворотки: сыворотку собирают либо при ее отделении от сгустка при отстаивании крови, либо путем центрифугирования стерильно взятой крови из вены. В холодильнике сыворотку можно хранить при температуре 4°С до 5 дней. В лаборатории полученная сыворотка инактивируется при температуре +5б°С в течение 30 мин. Тестирование выполняется на прозрачных полистироловых пластинах с углублением (МРП) или на специальных картонных пластинах (RPR). 
Оценка результатов 
Результаты МРП читают в проходящем свете на черной основе или над световым источником невооруженным глазом или с помощью лупы. В углублениях, где находится плазма или сыворотка больного сифилисом в различных количествах образуются белые хлопья разного размера. Если в углублении отмечаются большие хлопья или их конгломераты, и окружающая жидкость становится прозрачной, результат считается положительным (4+, 3+). Мелкие хлопья - результат слабо положительный (2+, 1+). В отрицательном случае хлопья не образуются (негативный). В сомнительных случаях (+\-) следует ориентироваться по «отрицательному контролю». Если в углублении отрицательного контроля хлопья не образуются, результат оценивается как сомнительный (+\-). Исследование продолжается количественным методом, путем разбавления сыворотки, поскольку необходимо исключить так называемый феномен «прозоны>, когда в неразведенном образце плазмы или сыворотке преципитат не образуется, а при его разведении возникают хлопья. 
Для проведения RPR-теста используются готовые к употреблению сертифицированные реагиновые комплексы. 
Количественный метод МРП, RPR используется для определения количества антител в образце исследуемой сыворотки во время и после лечения. 
Возможные ошибки 
Неправильное взятие крови из пальца - в капилляре находятся пузырьки, неточно фиксируется отметка на капилляре. 
1. В реакции отсутствует контрольная сыворотка (также слабо положительной). 
2. В готовой эмульсии неравномерная концентрация антигена по причине недостаточного перемешивания перед применением. 
3. Бактериальное инфицирование рабочего раствора. 
4. Несоблюдение правил хранения и изготовления плазмы, сыворотки, антигенов и их рабочего раствора. 
5. Использование двухвалентного цитрата натрия вместо трехвалентного. 
6. Нарушение правил использования посуды, пипеток, несоблюдение порядка исследования. 
Несоблюдение упомянутых правил может давать как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты.

Специфические (трепонемные) тесты

С помощью специфических тестов в сыворотке больного сифилисом обнаруживаются антитела, образованные в организме к специфическим антигенам Treponema pallidum. Трепонемные тесты используются для постановки и подтверждения диагноза, а также в дифференциальной диагностике. Для специфических тестов характерны большая чувствительность и высокоспецифичные результаты. Механизмы специфических тестов не одинаковы, с их помощью можно обнаружить различные антитела, поэтому показания к их использованию различаются. Назначая эти исследования, врач должен понимать сущность каждого теста, уметь обосновать свой выбор, ориентироваться в разнообразных тестах, чтобы выбрать оптимальный вариант для постановки диагноза и соответствующего лечения, а также сделать заключение о его результатах. 
К трепонемным тестам, наиболее часто используемым в диагностике относятся РПГА и И ФА.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА, ТРНА)

Принцип метода 
Syphilis TPHA-Test (Treponema pallidum haemagglutination test) - реакция непрямой гемагглютинации, которую используют для выявления специфических антител к Treponema pallidum. Эритроциты барана или петуха сенсибилизируются антигеном Treponema pallidum. В присутствии антител происходит агглютинация сенсибилизированных клеток - в микролунках образуются специфические рисунки. Клеточная суспензия содержит также трепонемный экстракт Рейтера, который абсорбирует непатогенные трепонемные антитела. 
Исследуемый материал 
Исследуется только сыворотка. Не подходят гемолизированные и мутные образцы. Образцы можно хранить 24 часа от +2 до + 8°С, или до 4 недель при температуре - 20°С. 
Характеристика метода РПГА - хороший диагностический тест, однако положительные результаты необходимо подтверждать с помощью какого-либо другого специфического теста диагностики сифилиса. В случае излеченного сифилиса результаты РПГА могут длительно оставаться положительными. Ложноположительные результаты наблюдаются в случае лепры, инфекционного мононуклеоза, а также в случае заболеваний соединительной ткани. Результаты читают через 45-60 минут. 
Интерпретация результатов 
Результаты оцениваются по системе «4+». - Отрицательный результат определяется тогда, когда в центре лунки с сывороткой для теста образуется ясная и четкая точка из неагглютинированных клеток с/или без очень маленького просвета в центре. Сомнительный результат определяется тогда, когда в центре точки из неагглютинированных клеток вместо маленького просвета появляется кольцо небольшой плотности на прозрачном фоне. Такие образцы необходимо тщательно проверить повторно (+/-, «1+» - сомнительный). Положительный результат определяется в том случае, когда клетки агглютинируют, образуя подобный поляне участок, вокруг которого формируется кольцо. В зависимости от его величины результат реакции оценивается соответственно «2+», «3+» или «4+». 
Если в контрольной лунке теста наблюдается точка неагглютинирующих клеток, это значит, что сыворотка пригодна к тестированию. 
Если в контрольной лунке теста произошла реакция, это значит, что в исследуемом образце содержатся неспецифические агглютинины. Сыворотка для тестирования непригодна и ее необходимо тщательно обработать.

Количественный метод РПГА

Для контроля эффективности лечения можно использовать количественный метод РПГА - определение титра антител. Титрование рекомендуется выполнять при резко положительных пробах, которые оценены как «4+», так как результат «4+» бывает в том случае, если титр пробы > 1:80. 
Интерпретация результатов 
Если в контрольной лунке гемагглютинация не происходит, то наблюдаемая гемагглютинация в лунках теста свидетельствует, что проба положительная. Титр определяется по последнему разведению, которое указывает на результат <4+»: 
1. разведение в лунке 1:80 
2. разведение в лунке 1:160 
3. разведение в лунке 1:320 и т. д. Титровать результаты «3+» или «2+» нет необходимости. 
Для исследования каждой пробы необходимо использовать также положительные и отрицательные контрольные сыворотки РПГА. Отрицательная контрольная сыворотка всегда демонстрирует выраженную точку, положительная контрольная сыворотка - гемагглютинацию «4+». 
Для РПГА характерна высокая чувствительность, с ее помощью можно обнаружить очень небольшое количество антител в сыворотке. Тест после лечения негативируется очень медленно, он может показывать слабоположительные результаты многие годы после выздоровления.

Тесты иммуноферментного анализа - ИФА

Тест принадлежит к иммуноферментным тестам, которые в последнее время широко используются в мире для диагностики различных инфекционных заболеваний. В диагностику сифилиса ИФА начали внедрять в 80-е годы, когда были разработаны и сертифицированы диагностические тесты и стандартизирована методика тестирования. 
В основе теста лежит непрямой метод Кунса. В сыворотке больного обнаруживаются специфические антитела. По чувствительности и специфичности тест сравним с иммунофлуоресцентными тестами. С помощью ИФА-теста можно выявить антитела всех существенных классов (IgM, IgA, IgG). Особенно ценен ИФА-тест в ранней диагностике сифилиса, поскольку он становится положительным уже в конце инкубационного периода. ИФА-тест является идеальным методом диагностики, подходящим для одновременного исследования большого числа образцов. Его рекомендуется использовать при обследовании беременных, контактных лиц, доноров и представителей групп риска. ИФА используется также как подтверждающий тест для образцов, демонстрирующих положительные результаты при использовании различных неспецифических тестов и РПГА. 
Серологическую диагностику сифилиса затрудняют присутствие в крови ревматоидного фактора, других антител и перекрестные реакции с другими родственными бактериями, например, Treponema phagedenis и Borrelia burgdorferi. При использовании ИФА-теста эти факторы практически не влияют на результаты. Высокая концентрация липидов, гемолиз пробы не являются препятствиями для тестирования, как в случае большинства других тестов. 
ИФА-тест позволяет определять все существенные классы антител и показывает высокую степень чувствительности на всех стадиях болезни (чувствительность теста 97-98%, специфичность - 98,5-99%). Отрицательный результат ИФА исключает сифилитическую инфекцию с большой степенью вероятности. В последние годы созданы тест-системы для определения отдельных классов антитрепонемных антител IgM-ИФА, IgG-ИФА. ИФА может оставаться положительным долгие годы даже у пролеченных пациентов, поэтому не используется как критерий выздоровления. У ИФА-тестов не наблюдается феномен «прозоны», который дает ложноотрицательные результаты при других методах тестирования, так как титр специфических антител очень высокий. 
Принцип метода 
1. АГ осаждают на лунках полистиролового 
планшета. 
2. Добавляют исследуемую сыворотку, образуется комплекс «АГ+АТ». 
3. Добавляют антитела к иммуноглобулинам человека, меченные энзимом. 
4. Добавляют субстрат, изменяющий цвет, и по интенсивности окраски определяют активность энзима. Цвет раствора зависит от количества антител в исследуемой пробе. 
С помощью этого метода можно определить антитела IgG и IgM вместе, а также антитела класса IgM отдельно. Результаты расцениваются как «положительные» или «отрицательные».

Тесты, подтверждающие диагноз сифилиса

Иммунофлюоресцентные тесты - РИФ (FTA) 
К этой группе относятся: РИФ-200, РИФ-абс (FTA-abc), IgM РИФ абс (IgM FTA-abc), РИФ ликв. 
Начиная с 60-х годов XX столетия для подтверждения и дифференциальной диагностики сифилиса широко используются чувствительные и специфические иммунофлюоресцентные тесты. Антитела-иммунофлюоресцины, определяемые с помощью таких тестов, раньше всего появляются в сыворотке, поэтому тест становится положительным к концу первой недели после инфицирования. Это позволяет диагностировать сифилис, когда другие тесты (кроме ИФА) остаются отрицательными. РИФ-абс при первичном серонегативном сифилисе является положительной в 87% случаях в конце второй и начале третьей недели после появления первичного аффекта. Чтобы уменьшить количество ложноположительных результатов (РИФ-абс - 2,8-3%), рекомендуется использовать комплекс реакций - РИФ-абс + РИФ-200. Ложноположительные результаты при РИФ-200 наблюдаются примерно в 2% случаев. В случае вторичного сифилиса РИФ-абс положительна в 100%, в случае поздней формы заболевания - в 92-100%, в случае специфического поражения внутренних органов - в 94-100%. Даже после лечения сифилиса РИФ-абс очень долго дает положительные результаты, поэтому она не применяется для определения эффективности лечения, если только не используется количественный метод РИФ-абс - определение титра антител. 
В последние годы все чаще используется реакция IgM РИФ-абс. В сыворотке больного IgM антитела появляются раньше остальных. Этот тест применяется в ранней диагностике, при обследовании контактных лиц, для контроля эффективности лечения, в дифференциальной диагностике рецидива и реинфекции, а также в случае врожденного сифилиса или для определения присутствия материнских антител у новорожденных. 
Как известно, из-за большой молекулярной массы IgM антитела не проникают сквозь плацентарный барьер. В крови матери (больной сифилисом) циркулируют преимущественно IgG антитела, для которых плацентарный барьер не является препятствием, и которые поступают в кровяное русло ребенка. При наличии в сыворотке новоровденного IgM антител, нужно думать о заражении сифилисом. В мире до сих пор нет единого мнения о длительности циркуляции IgM антител в сыворотке больного. Большинство авторов считает, что они достигают своего максимума на 6-9 неделе, и не обнаруживаются после 18-месячного возраста. Немецкий ученый Миллер предполагает, что IgM циркулируют до исчезновения клинических симптомов, О'Нил - что IgM циркулируют в крови до 5 лет. По данным Миллера, в 60% случаев Syphilis lateens praecox IgM в сыворотке больше не обнаруживаются. Если лечение начинается рано, IgM исчезают в течение 5-6 месяцев, если лечение начинается позже - они сохраняются в течение 1-2 лет. Некоторые авторы используют реакцию IgM РИФ-абс как критерий излеченности. 
Принцип метода 
Исследуемая сыворотка подвергается инкубации вместе с Treponema pallidum (антиген), которая фиксируется на предметном стекле. В случае положительного результата образуется комплекс «антитело + антиген», связанный с обработанными флюоресцеинами антителами к человеческим глобулинам. Перед началом тестирования исследуемую сыворотку обрабатывают сорбентом (непатогенный экстракт Treponema Reiteri), чтобы исключить реакцию связывания неспецифических антител. 
В результате получают свечение иммунных комплексов различной интенсивности, которую определяют с помощью люминесцентного микроскопа. 
Оценка результатов 
Исследование выполняется с помощью люминесцентного микроскопа (ртутно-кварцевая лампа с иммерсионной системой, окуляр с 4-х или 5-кратным увеличением, фильтры в зависимости от марки микроскопа). Результаты 
оцениваются по интенсивности свечения иммунных комплексов. 
Положительно оцениваются препараты, которые дают свечение 4+, 3+, 2+. Желто-зеленая люминесценция оценивается как 4+, ярко-зеленое свечение - 3+, бледно-зеленое свечение - 2+. При выраженности свечения 1+ реакция считается отрицательной (в препарате наблюдается фоновое окрашивание или окрашивание отсутствует - определяются только тени). Результат «2+» необходимо проконтролировать с помощью других специфических тестов.