Физико-химические методы исследования флавоноидов

1.3 Физико-химические методы исследования флавоноидов

1.3.1 Оптические методы определения  флавоноидов

Спектрофотометрический  и фотоколориметрический анализы  являются разновидностями молекулярно-абсорбционного спектрального анализа. Сущность молекулярно-абсорбционного спектрального анализа заключается  в качественном и количественном определении веществ по их спектрам поглощения.

Количественное определение  исследуемых флавоноидных соединений в УФ- и видимой области спектров основано на измерении оптической плотности при длине волны в максимумах поглощения как растворов анализируемых веществ, так и растворов их окрашенных комплексов.

Спектрофотометрическое  определение по максимумам собственного поглощения в разновидности прямой спектрофотомерии или дифференциальной спектрофотомерии является одним из наиболее распространенных методов  анализа флавоноидов. При этом рабочими диапазонами длин волн служат как длинноволновые максимумы для флавоноидов – 330-370 нм, так и коротковолновые. Коротковолновые максимумы, хотя и более интенсивны, но в ряде случаев менее пригодны для аналитических целей из-за малой площади вершины пика, что приводит к большим ошибкам определения. Относительная ошибка прямого спектрофотометрического определения составляет ± 2-5 % и может быть снижена при дифференциальной методике анализа до 0.5-1.0 %.

Рабочий интервал концентраций спиртовых, спиртоводных растворов  составляет от 5 до 20 мкг вещества в 1 мл раствора. Обладая высокой чувствительностью, метод не селективен, так как не контролирует содержание каждого из веществ одного класса соединений и не позволяет судить о качественном составе материала.

Большой специфичностью обладают методики определения флавонолов по цветным комплексным соединениям с хлоридом алюминия, хлорокисью циркония (хлористым цирконилом), нитратом галлия. Окрашенные растворы имеют максимумы в интервалах: 385-460 нм с хлористым алюминием, 385-500 нм с хлористым цирконилом, 400-455 нм с азотнокислым галлием. Наибольшей чувствительностью обладает методика с применением нитрата галлия, позволяющая количественно определять 0.5 мкг в 1 мл раствора, затем с хлорокисью циркония – 0.9-1.0 мкг и с хлористым алюминием – 1-2 мкг.

Описаны методики анализа  флавоноидов с нитритом кобальта в среде уксусной кислоты при длине волны 575 нм, а также с цинком и мышьяком. Получить истинное суммарное содержание флавоноидов по образованию цветных комплексов с металлами возможно лишь при наличии у соединений одинакового количества комплексообразующих центров. Отсутствие таковых у целого ряда соединений приводит к отрицательной реакции с данными реактивами.

Несмотря на указанные  недостатки, метод нашел широкое  применение при установлении суммарного содержания флавоноидов в сырье и суммарных фитохимических препаратах. В качестве стандарта используют кверцетин, кемпферол или их гликозиды.

Широко распространена при  определении общего количества флавоноидных соединений в растениях методика фотометрического определения по реакции комплексобразования с борной кислотой при длине волны 470 нм (т.н. борно-лимонная реакция).

Методика обладает теми же недостатками, что и методика комплексобразования с солями металлов, и дает завышенные результаты, но простота проведения и доступность реактива дают возможность использовать их для ориентировочных определений. В качестве образцов используют как агликоны, так и гликозиды флавонов, флавонолов, халконов. Рабочая концентрация растворов 1-10 мкг/мл. Относительная ошибка определения ± 3.35 %.

В ряду спектрофотометрических методов анализа флаванонов наиболее чувствителен боргидридный метод (до 0.5-1 мкг/мл при длинах воли 535-560 нм). Несмотря на значительную селективность, он не имеет широкого применения из-за малого времени устойчивости окрашенного комплекса и плохой воспроизводимости результатов.

Комплексонообразующие свойства флавоноидов положены в основу флуорометрического метода, являющегося на порядок более чувствительным, чем спектрофотометрический. Количественно оценить флавоноиды этим методом возможно при наличии 0.05-1 мкг вещества в 1 мл раствора. Высокая чувствительность флуорометрического метода раскрывает широкие возможности его применения для предварительной идентификации биологически активных веществ в тканях растений. Однако получить объективные результаты при анализе сырья и фитохимических препаратов можно только после разделения веществ с помощью различных видов хроматографии [19].

В целом для флавоноидов характерно поглощение в УФ-видимой области спектра (210-600 нм). Спектр поглощения флавоноидного соединения содержит, как правило, две полосы: одна из них в низковолновой (210-290 нм) части – полоса II, другая – в более длинноволновой (320-380 или 490-540 нм для антоцианидинов) части – полоса I.

Положение полос поглощения служит в некоторой степени характеристическим признаком отдельных групп флавоноидов. Так, флаваноны и флаванонолы отличаются от других групп флавоноидов положением полосы II в области 270-290 нм и наличием полосы I в виде плеча при 310-330 нм (рисунок 1.12). В то время как для флавонов и флавонолов специфическим признаком служит положение полосы I в области 320-355 и 340-385 нм соответственно (рисунок 10). Для халконов характерно положение полосы II в несколько более длинноволновой области (рисунок 1.13).

 

Рисунок 1.12 – Положение  полос поглощения в УФ-видимой области спектра для изофлавона (1) и флавонона и флавононола (2)

 

Рисунок 1.13 – Положение  полос поглощения в УФ-видимой области спектра для флавона (1), флавонола (2) и халкона (3)

 

Внутри каждой группы флавоноидов выявлена более «тонкая» картина зависимости положения максимумов полос поглощения от структуры соединения. Например, у ряда флавонов с одинаковым 5,7-дигидроксизамещением кольца А полоса I перемещается в более длинноволновую область по мере возрастания числа гидроксильных групп в кольце В (таблица 1.4).

 

Таблица 1.4 – Зависимость  положения максимумов полос поглощения ОН-группы в кольце В у ряда флавонов

Положение ОН-группы в кольце В		Полоса I
Хризин	–	313 нм
Апигенин	4'	336 нм
Лютеолин	3',4'	349 нм
Трицетин	3',4',5'	354 нм

 

Абсорбционная спектроскопия  флавоноидов хорошо изучена, и выявленные закономерности широко используются в целях идентификации и установления строения новых соединений. Особенно информативной является процедура добавления шифт-реагентов, каждый из которых предназначен для выявления определенных «диагностических» признаков в структуре исследуемого соединения [ссылка].

Шифт-реагенты принято добавлять к раствору исследуемого флавоноидного соединения в метаноле (в случае антоцианов и/или антоцианидинов – в метаноле с 0.01% хлороводородной кислоты). После добавления шифт-реагента в исходном спектре происходит сдвиг полос поглощения и по характеру этих изменений делается вывод о наличии (или отсутствии) в соединении определенных структурных фрагментов.

Часто шифт-реагенты используются для обнаружения в структуре соединений:

1. гидроксильных групп с наиболее выраженными кислотными свойствами (7-ОН, 4'-ОН);
2. хелатообразующего фрагмента, т. е. сочетания 4-оксогруппы с 3-ОН- и/или 5-ОН-группами.

Гидроксильные группы различаются  по кислотности и располагаются  в следующий ряд: 7-ОН > 4'-ОН > 3'-ОН > 5-ОН. Для доказательства наличия  в структуре свободной наиболее кислой 7-ОН-группы служит слабощелочной  шифт-реагент – ацетат натрия (таблица 1.5). Несколько миллиграммов плавленого ацетата натрия добавляют к аликвоте исходного метанольного раствора исследуемого вещества, снимают спектр и сравнивают со спектром исходного раствора.

 

Таблица 1.5 – Шифт-проба с ацетатом натрия

Группа флавоноидов	Полоса поглощения	Сдвиг, нм	Детектируемый структурный  признак
Флавоны	I	+ (5-20)	Свободная 7-ОН-группа
Флавонолы
Изофлавоны
Флаваноны	II	+ (30-60)	Свободная 7-ОН-группа
Флаванонолы

 

 

Для доказательства свободной 4'-ОН-группы (одновременно с 7-ОН-группой) используется более сильный щелочной реагент — метоксид натрия (таблица 1.6). При этом к аликвоте метанольного раствора исследуемого соединения добавляют 2-3 капли шифт-реагента; снимают спектр сразу и еще после 3-5 минут стояния.

Для дигидрокемпферола (рисунок 1.14) на рисунке 1.15 приведен УФ-спектр, полученный с использованием шифт-агентов.

 

Таблица 1.6 – Шифт-проба с метоксидом натрия

Группа флавоноидов	Полоса поглощения	Сдвиг, нм	Детектируемый структурный  признак
Флавоны Флавонолы	I	+ (45-65) (без изменения интенсивности)	Свободная 4’-ОН-группа
		Снижение интенсивности  со сдвигом или без сдвига	Замещенная группа 4’-OR
		Снижение интенсивности  и деградация через 3-5 мин.	Свободная 3’,4’-дигидрокси- или тригидроксигруппировка
		Появление новой слабоинтенсивной полосы 320-335 нм	Свободная 7-ОН-группа
Флавононы Флавононолы	II	Сдвиг с 280 до 325 нм	Свободная 7-ОН-группа
		Отсутствие сдвига	Замещенная 7-OR-группа
Халконы Ауроны	II	Появление красного или оранжевого окрашивания и сдвиг на 50 нм с возрастанием интенсивности	Свободная 4-ОН-группа (халконы)
			Свободная 6-ОН-и/или 4’-ОН-группы (ауроны)

 

Рисунок 1.14 – Химическая структура дигидрокемпферола

 

Рисунок 1.15 – УФ-спектр дигидрокемферола с использованием шифт-агентов

 

Шифт-проба с ацетатом натрия для дигидрокемпферола (рисунок 1.14) приводит к батохромному сдвигу полосы II на 36 нм, что соответствует наличию 7-ОН-группы во флаванонолах (табл. 6). В то же время артеметин, в структуре которого присутствуют замещенные (метилированные) гидроксильные группы в положениях 7 и 4', не дает положительной шифт-пробы с ацетатом натрия (отсутствует батохромный сдвиг полосы 1).

Широко используемой является реакция взаимодействия флавоноидов с хлоридом алюминия. Флавоноиды способны образовывать комплексные соединения с включением ионов А1³⁺. Считается, что в образовании комплекса с ионами металлов могут участвовать три центра в структуре молекулы флавоноида (рисунок 1.23).

 

Рисунок 1.23 – Возможные  центры хелатирования флавоноидами ионов металлов

 

В результате комплексообразования в УФ-спектрах поглощения наблюдается сильный батохромный сдвиг полос поглощения I или II в зависимости от типа флавоноидного соединения (таблица 1.7). Для определения центров комплексообразования – снимают спектр (1) метанольного раствора исследуемого раствора исследуемого вещества. К аликвоте метанольного раствора исследуемого вещества добавляют 2-3 капли 5%-го метанольного раствора А1С1₃ и снимают спектр (2). Спектры (1) и (2) сравнивают между собой [ссылка].

Например, в УФ-спектре кверцетина максимум полосы I сдвигается с 375 до 435 нм (батохромный сдвиг) и соответственно раствор приобретает яркое желтое окрашивание. На этом основано использование спиртового раствора AlCl₃ в качестве проявляющего реагента в ТСХ флавоноидов.

Для рамнетина, в молекуле которого в комплексообразовании могут участвовать три центра, шифт-проба с AlCl₃ приводит к батохромному сдвигу полосы I на 80 нм (рисунок 1.17), а в артеметине, где возможность комплексообразования ограничена одним центром, поскольку имеется только одна свободная ОН-группа в положении 5, батохромный сдвиг в результате шифт-пробы с А1С1₃ составляет 32 нм (рисунок 1.15). Отсутствие в молекуле 5-ОН-группы и возможность участия в комплексообразовании только двух других центров, как это показано на рисунке 1.22 на примере физетина, приводит тем не менее к довольно большому батохромному сдвигу – на 96 нм.

 

Таблица 1.7 – Шифт-проба с хлоридом алюминия

Группа флавоноидов	Полоса поглощения	Сдвиг, нм	Детектируемый структурный  признак
Флавоны Флавонолы	I	35-70 Нет сдвига	Свободные 5-ОН-и/или 3-ОН-группы Отсутствуют или амещены 3-ОН-и/или 5-ОН-группы
Флаваноны Флаванонолы Изофлавоны	II	10-25	Свободная 5-ОН-группа
Халконы Ауроны	I I	40-64 60-70	Свободная 2’-ОН-группа Свободная 4-ОН-группа

Для дигидрофлавонолов в целом шифт-пробы с А1С1₃ характеризуются меньшими бахромными сдвигами. Например, в случае дигидрокемферола бахромный сдвиг равен 25 нм (рисунок 1.15), а дигидрофизетина – 31 нм (рисунок 1.22).