Penicillium griseofulvum продуцент антибіотика гризеофульвіну

Види Penicillium віддають перевагу прохолодному та помірному клімату, який зазвичай присутній скрізь, де органічний матеріал доступний, тобто P. griseofulvum росте в інтервалі темпертур 10 – 38 ⁰С, це означає що він мезофільним. Пряме світло пригнічує ріст гриба, але чергування освітлення і темноти стимулює і спороутворення [19].

P. griseofulvum є осмотолератним, тобто росте при високій вологості, але здатний витримувати низький рівень води в середовищі. Велике значення для P. griseofulvum має аерація. Максимальне його накопичення відбувається при інтенсивності аерації, близькою до одиниці, тобто вони аеротолерантими мікроорганізмами. Зменшення інтенсивності аерації або її надмірне збільшення знижує вихід антибіотика та мікотоксинів. В залежності від pH може змінювати культуральні, морфологічні ознаки та впливає на фізіологічну активність гриба. Отже, кількість клітин краще розвиваєть при pH = 4,5 – 5,5. А синтез антибіотику інтенсивніший при pH = 6,5 - 7,2 [19, 21].

5.3 Таксономічний статус

Відділ - Аsсотусоbacteria

Клас - Аsсотусоbacteria

Підклас – Аsсотусоtа,

Порядок – Eurotiales,

Родина – Trichocomacea,

Рід – Penicillium,

Вид –  griseofulvum [26].

 

5. 4. Схема біотрансформації  ростового субстрату.

5. 4. 1. Шляхи біоснтезу антибіотика гризеофульвіну з глюкози та лактози

При культивувані Penicillium griseofulvum MTCC 2004 на поживному середовищі наступного складу (г/л): кукурудзяний екстракт – 1; глюкоза – 11; лактоза – 28; KH₂PO₄ – 0,5; NaNO₃ – 3, KCl – 1; MgSO₄ 7H₂O – 0,25; MnSO₄ H2O – 0,02; ZnSO₄ 7H₂O – 0,044 і CaCO₃ 2H₂0 – 1, джерелом вуглецю буде слугувати лактоза. Біосинтез даного антибіотика здійснюється шляхом полімеризації ацетатних одиниць [19].

Елементарні одиниці  з яких складається гризеофульвін  є одна ацетатна (ацети-КоА) та шість  мамалонатних (малоніл-КоА) одиць. Ацетил-КоА утворюється шляхом окиснення пірувату. Реакція каталізується мультиферментним піруватдегідрогеназним комплексом, який складається з трьох ферментів, один з яких є піруватдегідрогеназа. Малоніл-КоА утворюється шляхом карбоксилювання ацетил-КоА.

Для подовження ланцюга спочатку вони повинні активуватися, яка відбувається за рахунок тіоефірного  зв’язку з коферментом А (КоАSH). Завдяки наявності тіоефірного зв’язку ацетил-КоА та малоніл-КоА переносяться на ферментну систему, що здійснює полімеризацію. Ацетил-КоА безпосередньо бере участі тільки в ініціації ланцюга, а малоніл-КоА є основною мономерною одиницею. Але як малоніл-КоА утворюється карбоксилюванням з ацетил-КоА, то вважають що ланцюг будується з ацетатних одиниць [8].

Далі відбувається конденсація, без відновлення карбоксильних груп і уворюється полікетидний ланцюг у якому чергуються метиленові і карбонільні групи. Метиленові групи у цій структурі високоактивні і конденсуються з карбонільними групами з утворенням ароматичної структури (бензофенон), яка далі перетворюється на гризеофен С, гризеофен В та гризеофен А, який в свою чергу перетворюється на гризеофульвін. На (рис. 9) показано головні етапи синтезу гризеофульвіну [7, 25].

Глюкоза

                                                                  1   ^АТФ

Глюкозо-6-фосфат

                                                                  2  

Фруктозо-6-фосфт

                                                                  3   ^АТФ

Фруктозо-1,6-фосфат

                                                                  4  

                                            Гліцеральдегід-3-фосфат    ⁵     Діоксиацетонфосфат

                                                                  6    ^2НАДН

1,3-Дифосфатгліцерат

                                                                  7   ^2АТФ

3-Фосфогліцерат

                                                                  8

2-Фосфогліцерат

                                                                  9  

               Оксалоацетату    ¹⁰     Фосфоенолпіруват

                                                                11   ^2АТФ

    Піруват

12

                 Малоніл-Ко-А              Ацетил-Ко-А

 

Конденсація та часткове відновлення

                                                         Бензофенон                 Гризеофен С Гризеофен В                Гризеофен А                 Гризеофульвін

Рис. 9 Узагальнена схема синтезу антибіотика гризеофульвіну:

ферменти: 1 - гексокіназа; 2 - глюкозофосфатізомераза; 3 - фосфорукто - кіназа; 4 - фруктозодифосфатальдолаза; 5 - триозофосфатізомераза; 6 - гліцератальдегід-фосфатдегідрогеназа; 7 - фосфогліцераткіназа; 8 - фосфогліцератмутаза; 9 - енолаза; 10 - фосфоенолпіруваткарбоксилаза; 11 - піруваткіназа, 12 - піруватдегідрогеназа.

 

РОЗДІЛ 6. Опис технологічного процесу біосинтезу гризеофульвіну

6.1. Підрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу

Penicillium griseofulvum є продуцентом антибіотику гризеофульвіну. Для процесу культивування використовують ферментер, загальний об’ємом - 1 м³; коефіцієнт заповнення Кзап. = 0,6. Звідси слідує, що робочий об’єм ферментера:

Vроб. = Vзаг. × Кзап  = 1 × 0,6 = 0,6 м³ = 600 л.

Спочатку потрібно визначити кількість стадій підготовки посівного матеріалу для приготування 600 л культуральної рідини. Кількість посівного матеріалу становить близько 10 % від загального об’єму поживного середовища. Отже потрібно розрахувати кількість посівного матеріалу для кожної генерації клітини.

1. Для приготування 600 л культуральної рідини, потрібно мати : 600 × 0,1 = 60 л посівного матеріалу.
2. Щоб приготувати 60 л культуральної рідини, потрібно мати: 60 × 0,1 = 6 л посівного матеріалу.
3. Щоб приготувати 6 л культуральної рідини, потрібно мати: 6 × 0,1 = 600 мл посівного матеріалу. Таку кількість посівного матеріалу можна приготувати на качалкових колбах.

Підготовка  посівного матеріалу склається  з 3 етапів, четвертим етапом буде процесс  біосинтезу.

Технологічна  схема процесу біосинтезу гризеофульвіну наведено в додатку 17

6.2 Опис технолічного процесу біосинтезу гризеофульвіну

ДР.1. Санітарна підготовка виробництва

ДР.1.1. Підготовка персоналу до роботи

Персонал одягнений  в технологічний одяг. Переміщення  і ходіння персоналу обмежене. У виробничих приміщеннях забороняється  прийом їжі.

 

 

ДР.1.1.1. Навчання персоналу

Персонал проходить  інструктаж або навчання для роботи в певному класі чистоти. Проводять  два раз на рік.

ДР.1.1.2. Перевірка знань персоналу

Після проведення інструктажу персонал перевірять на закріплення знань роботи в певному класі чистоти та з певним обладнанням. Проводять два раз на рік.

ДР.1.1.3. Підготовка персоналу до роботи

Полягає в забезпеченні персоналу спеціальним одягом, взуттям, рукавицями та респіраторними масками. Одяг повинен бути виготовлений зі спеціальної тканини. Вона повинна мати мінімальне ворсовиділення, пилемісткість, пилопроникність та повітрепроникність. В умивальнії кімнаті персонал миють руки під краном теплою водою до двох хвилин, використовуючи мило туалетне. Для видалення мила руки ополоскують теплою водою і висушують електрорушником або стерильною серветкою і обробляють 76 % етиловим спиртом.

ДР.1.2. Підготовка технологічного одягу

Підготовка  одягу на біотехнологічному підприємстві складається: сортування та перегляд одягу на цілісність та ступінь забруднень, прання, ополіскування та віджим, сушіння, упаковка та зберігання одягу. Одяг повинен бути виготовлений зі спеціальної тканини. Важливою також є частота зміни одягу, яка залежить від пори року і кліматичних умов.

ДР.1.3. Приготування миючих та дезінфікуючих засобів

Робочі розчини  миючих та дезінфікуючих засобів готують у спеціальній тарі з корозійно-стійких матеріалів. Приготування розчинів проводиться у спеціальній кімнаті, що прилягає до санвузла. Посуд, де зберігаються розчини, обов'язково повинен бути щільно прикритим кришкою або корком та на ньому повинен бути напис коли приготований даний розчин.

ДР.1.3.1. Приготування розчину хлораміну Б

Для приготування 2 % розчину хлораміну Б беруть 20 г сухого хлораміну Б засипають у мірну колбу на 1 л та доводять до позначки водопровідною водою. Вода, що додається до хлораміну Б повинна бути 50 – 60 °С, тривалість приготування 10 - 15 хв. Зберігати готовий розчин слід не більше 15 діб. Розчин подають до ДР.1.1.4; ДР.1.4.2.

ДР.1.3.2. Приготування розчину каустичної соди

Для приготування 2 % розчину каустичної соди беруть 20 г сухої каустичної соди засипають його у мірку колбу на 1 л води та доводять до мітки водопровідною водою, температура води повинна бути 20 °С, тривалість приготування 10 - 15 хв. Зберігати готовий розчин слід не більше 10 діб. Приготований розчин зберігають у герметично закритому скляному посуді в прохолодному місці. Розчин подають на ДР.1.5.2.

ДР.1.3.1. Підготовка 76 % етилового спирту

Етиловий спирт з концентрацією 76 % готують для оброблення боксів. Персонал протирає стіл перед початком роботи та руки для запобігання контамінації. Розчин подають до ДР.1.1.3; ДР.1.4.4.

ДР.1.4. Підготовка виробничих приміщень

ДР.1.4.1 Щоденне прибирання

Підготовку  приміщень проводять з хлораміном 2% від ДР.1.3.1. після кожної зміни. Проводять вологе прибирання підлоги, столів поролоновою губкою, яка добре змочена дезінфікуючим розчином. Мити поверхні слід поступовими рухами, захоплюючи щоразу 1/3 частини раніше протертої площі. Для протирання столів та боксів користуємось розсином спирту від ДР.1.3.3.

ДР.1.4.2 Генеральне прибирання

Проводять миття розчином хлораміну 6 % від ДР.1.3.1. Протираюсь стелі, двері, підлогу всієї дільниці. Проводять очищення каналізаційної системи, а також виконують усі заходи щоденної підготовки. Проводять прибирання і наведення порядку в шафах, стелажах, очищення та дезінфекційну обробку повітроводів і вентиляційних камер, а також виконують усі заходи щотижневої підготовки приміщень.

ДР.1.5 Підготовка обладнання та комунікацій.

ДР.1.5.1. Зняття з’ємних частин обладнання та їх миття

З'ємні частини (вузли) обладнання, що безпосередньо  стикаються з лікарськими речовинами або засобами, слід зняти, розібрати  і ретельно вимити в розчині миючого  засобу. Відпрацьований розчин йде  до знешкодження відходів.

ДР.1.5.2. Миття обладнання

Через технологічне обладнання та комунікації пропускають  миючий засіб. З'ємні частини (вузли) обладнання вимиваються в розчині миючого  засобу при температурі 70 − 80 °С.

Миття устаткування проводять розчином каустичної соди 2 % від ДР.1.3.2. протягом 10 - 15 хвилин при 20°С, з поверненням розчину в збірник нейтралізації. Обробку ферментера проводять після кожного культивування, розчин каустичної соди в ферментері перемішують за допомогою. Проводиться ополіскування питною водою, з передачею води в збірник нейтралізації.

ДР.1.5.4. Перевірка на герметичність

Для герметизації фланців і вентилів використовують особливі прокладки з пароніту, обробленого  графітом, для герметизації кришок апаратів використовують шнур з прогумованої тканини діаметром до 19 мм, а для завантажувальних люків – гуму завтовшки 14 мм.

Ємкісне обладнання на герметичність перевіряють при повітряному тиску 0,5 – 0,6 МПа. Якщо упродовж 30 хв тиск (за манометром) не знижується, обладнання вважають герметичним. Для того щоб дізнатись де саме обладнання нещільне, потрібно скористатись методом омилювання розчином господарського мила. І по виділенню бульбашок виявляють нещільності. Далі знову перевіряють обладнання на герметичність.

ДР.1.5.4. Стерилізація

Стерилізація  устаткування здійснюється парою при  температурі 130 ⁰С і надлишковому тиску 0,3 МПа. Тривалість операції складає приблизно 30 хвилин. Після закінчення стерилізації зупиняють подачу гострої пари, ставлять всі вузли під паровий захист та знижують тиск. При зниженні тиску проводять охолодження до температури 90 ºС.

Для проведення стерилізації забезпечують такі умови, щоб в ферментері не залишилось сторонньої мікрофлори.

ДР.2. Підготовка стерильного технологічного повітря

ДР.2.1. Забір повітря

Забір повітря відбувається на висоті 30 м. Атмосферне повітря забирають турбокомпресором через забірну шахту. Повітря по повітропроводу надходить в головні фільтри грубого очищення.

ДР.2.2. Очищення повітря від пилу та механічних часток

Спочатку фільтрують повітря за допомогою волокнистих і пористих матеріалів від завислих часток. Ці частинки затримують завдяки інерційному і дифузійному механізму осадження. Таким способом вдається одержати повітря зі ступенем чистоти 80%.

ДР.2.3. Стиснення повітря

Далі виконують стиснення повітря у турбокомпресорі до 0,35 – 0,5 МПа, що приводить до підвищення його температури до 120 - 250 ^оС та збільшення вмісту вологи на одиницю об'єму.