Автор работы: Пользователь скрыл имя, 24 Октября 2014 в 18:17, реферат
Цитокины — эндогенные полипептидные и белковые медиаторы межклеточного взаимодействия, регулирующие эмбриональное развитие, некоторые нормальные физиологические функции организма, защитные реакции при внедрении патогенов и при развитии опухолей, формирование аллергических, аутоиммунных и иных иммунопатологических процессов и восстановление поврежденных тканей при травмах. Именно поэтому совершенно очевидно, что цитокиновая регуляция имеет огромное значение и в норме, и при патологии.
Как следует из табл. 19-3, большинство используемых в биологических тестах клеточных линий не обладают строгой специфичностью в отношении одного цитокина, а могут отвечать на действие еще некоторых медиаторов, что существенно снижает специфичность определения биологической активности цитокинов в культуральных средах и биологических жидкостях, где обычно одновременно содержится несколько десятков цитокинов. В то же время эти клеточные линии могут быть идеальным инструментом для оценки биологической активности рекомбинантных цитокинов. Во многих лабораториях производят искусственные клеточные линии, отвечающие на отдельные цитокины, путем трансфекции клеток генами рецепторов данных цитокинов. Трансфецированные клетки приобретают способность специфически отвечать на действие низких концентраций нужных цитокинов. Однако многие клетки экспрессируют рецепторы большого числа цитокинов, поэтому метод не в состоянии обеспечить абсолютную специфичность тестирования.
Клеточные линии, используемые для оценки уровня цитокинов человека, имеют различное происхождение. Большинство таких линий получены от пациентов с лейкемией либо при лабораторно индуцированной лейкемии. Некоторые цитокины человека не являются видоспецифичными, и для их изучения можно использовать клеточные линии мышиного происхождения, уровень цитокинов в образцах оценивается в основном по их способности стимулировать или ингибировать пролиферацию клеток. Существует несколько способов измерения пролиферации клеток:
1) подсчет клеток;
2) оценка синтеза ДНК по включению радиоактивно меченного тимидина.
Альтернативой радиоизотопным методам служат методы оценки клеточного метаболизма как индикатора пролиферации, основанные на восстановлении различных солей тетразолия. Кроме измерения пролиферативной активности для оценки уровня некоторых цитокинов, таких как TNF, используют методы, основанные на цитотоксической активности цитокинов. Здесь с помощью витальных красителей оценивают цитотоксический эффект по отношению к некоторым клеточным линиям. Для оценки интерферонового статуса используют методы, основанные на антивирусной активности интерферонов. При этом используются различные клетки-мишени, зараженные вирусом, на которых оценивается антивирусная активность интерферонов путем визуальной оценки жизнеспособности клеток или с помощью витальных красителей. Для оценки биологической активности хемокинов, в частности IL-8, применяют методы хемотаксиса, где определяют их способность привлекать клетки, измеряя при этом количество клеток, мигрировавших через мембрану Бойдена, либо длину пробега клеток в агаре.
В целом все методы оценки биологической активности цитокинов in vitro могут быть объединены в 5 основных групп.
1. Оценка пролиферативной активности клеток (стимуляция или подавление).
2. Оценка цитотоксичности.
3. Определение экспрессии мембранных рецепторов, синтеза других цитокинов.
4. Оценка влияния на функциональную активность клеток, что всегда зависит от типа клеток и от изучаемого цитокина, например оценка хемотаксиса либо оценка завершенности фагоцитоза.
5. Оценка противоинфекционного действия, как в случае интерферона.
Несмотря на очевидные достоинства, биологические методы имеют и ряд существенных недостатков:
* они являются трудоемкими и сложными в исполнении;
* требуют значительно больше времени до получения конечного результата;
* требуют особых стерильных условий и оборудования для постановки;
* являются менее специфичными, чем иммунохимические методы.
Иммунохимические методы.
Биологическая оценка активности цитокинов обладает целым рядом ограничений в области специфичности, воспроизводимости и точности (табл. 19-4). В связи с этим определение уровней цитокинов в различных биологических средах чаще всего проводят с использованием иммунохимических методов, основанных на применении поликлональных, а в настоящее время, главным образом, моноклональных антител, специфически взаимодействующих с молекулами цитокинов.
Иммунохимические методы чрезвычайно разнообразны и представлены следующими видами методик количественного определения концентрации растворимых цитокинов в различных биологических жидкостях.
• Иммуноферментный анализ в различных модификациях (ИФА; Enzyme- linked Immunosorbent Assay — ELISA).
• Радиоиммунный анализ (РИА). Чувствительность метода достаточно высока, но в последние годы радиоиммунологические методы используются все реже и заменяются ИФА, чтобы избежать работы с изотопами и уйти от использования дорогостоящих счетчиков радиоактивности.
• Мультиплексный иммунный анализ (МИА), позволяющий с помощью моноклональных антител одновременно определять до 100 белков с использованием флюоресцентных и других меток, в том числе с применением технологии микрочастиц или микрошариков, покрытых антителами, а также микрочипов (Bioplex, Multiplex analysis, Biochip Array Technolog). В этом варианте несколько цитокинов анализируют с использованием одного биочипа одновременно, что существенно экономит время и реагенты, однако стоимость оборудования для проведения такого анализа пока еще слишком высока.
• Цитофлюориметрические методы для анализа экспрессии поверхностных молекул клеток (мембранных форм цитокинов и рецепторов цитокинов) и определения цитокинов в цитоплазме клеток.,
• Метод оценки продукции цитокинов единичными клетками в культуре (ELISPOT).
• Иммуноцитохимия и иммуногистохимия для оценки содержания цитокинов в цитоплазме клеток на мазках и на срезах тканей.
Наибольшее распространение получили иммуноферментные диагностические тест-системы, позволяющие проводить количественный анализ содержания цитокинов в любых биологических жидкостях и обладающие достаточно высокой чувствительностью для определения уровней цитокинов у человека и животных. Принцип работы большинства современных тест-систем заключается в использовании «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа (рис.19-1).
19-1. Базовые принципы «сэндвич»-анализа на твердой фазе: А — слева ИФА, справа микрочастицы: В — слева нормальная реакция, посередине — ложноположительная реакция вследствие интерференции с ревматоидным фактором IgM класса, справа — угнетение реакции путем блокирования сайтов связывания иммуноглобулинами животных.
Для реализации этого варианта используют два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к определяемому цитокину. Первое из этих антител иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок) 96-луночного пластикового микропланшета стандартного формата для постановки ИФА. На первом этапе анализа исследуемый образец вносится в лунки, где происходит специфическое связывание определяемого антигена (цитокина) моноклональными антителами, сорбированными на поверхности лунок. После этого производится отмывка всего несвязавшегося с антителами материала буфером с детергентом. Этот важный этап позволяет удалить все неспецифически связывающиеся молекулы, но не влияет на специфическое высокоаффинное взаимодействие антител с определяемым цитокином. На второй стадии анализа связавшийся цитокин взаимодействует со вторыми антителами, конъюгированными с биотином. При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству цитокина в исследуемом образце. На последней стадии анализа в лунки вносят авидин-пероксидазу, взаимодействующую с биотином на вторых антителах. После этого в лунки вносят особый субстрат для фермента пероксидазы, меняющий цвет под действием фермента, например тетраметилбензидин, в результате чего происходит ферментативная реакция и окрашивание раствора в лунках. Возможно также использование наборов из трех антител, когда вторые антитела (например, поликлональные кроличьи антитела к цитокину) на последнем этапе взаимодействуют с антивидовыми антителами, конъюгированными с ферментом. В результате образуется «сэндвич» из двух или трех антител и молекулы антигена между ними. Количественную оценку концентрации цитокина в пробах проводят, сравнивая результаты с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартного образца цитокина. Иммуноферментные методы высокоспецифичны, быстры (время постановки иммуноферментного анализа составляет менее 5 ч) и относительно просты в исполнении. Порог чувствительности для таких тест-систем достигает 0,5 пкг/мл. В настоящее время в России широко доступны коммерческие варианты иммуноферментных систем для определения широкого спектра цитокинов. Большинство иммуноферментных тест-систем адаптированы для работы с любыми биологическими жидкостями. Для измерения уровней цитокинов на системном уровне используют сыворотку или плазму крови. Несмотря на короткий (минуты) период жизни и индуцибельный тип синтеза большинства цитокинов, в сыворотках крови здоровых доноров иногда определяются незначительные уровни цитокинов. Обычно их концентрации находятся на пределе чувствительности иммуноферментного метода, но при различных заболеваниях, связанных с острой или хронической продукцией цитокинов, сывороточные уровни цитокинов становятся значительно выше. Однако, поскольку цитокины являются локальными медиаторами, более целесообразно измерять их уровни в интересующих исследователя тканях после экстракции тканевых протеинов in vitro или в биологических жидкостях, при развитии воспаления, аллергии или аутоиммунных процессов значимые уровни цитокинов могут быть определены в слезной жидкости, жидкости десневых карманов, смывах из полостей, моче, спинномозговой жидкости и даже в конденсате выдыхаемого воздуха. Анализ данных определения цитокинов показывает, что благодаря использованию различных реагентов в ИФА и различиям в протоколах исследования, в разных лабораториях могут получаться не вполне сопоставимые результаты, даже если при этом используют одни и те же международные стандарты. Подобные различия можно объяснить использованием в тест-системах разных пар антител. Используемые в ИФА тест-системах антитела могут связываться с одними и теми же цитокиновыми молекулами, однако антитела могут не распознавать фрагменты цитокиновых молекул или их формы-предшественники. Для создания антител обычно используют рекомбинантные формы цитокинов, которые могут отличаться от естественных форм. Это может приводить к различиям в аффинитете связывания определяемых молекул с разными антителами. И хотя, как считается, ИФА является «золотым стандартом» для определения цитокинов, в настоящее время возможность определения таких сигнальных молекул с помощью этого метода ограничена. Это, прежде всего, касается одновременного исследования уровней большого числа цитокинов для более полной характеристики цитокиновой регуляции различных биологических процессов в норме и при патологии.
Таким образом, основными достоинствами ИФА являются:
С другой стороны, к основным недостаткам ИФА следует отнести:
Для оценки уровней цитокинов в различных биологических жидкостях наиболее распространенными методами мультиплексного иммунного анализа (МИА) являются мультиплексные методы, в основе которых лежит «сэндвич»-метод в разных комбинациях — FAST Quant, Search Light и xMAP. Каждый из этих методов имеет некоторые различия по ряду параметров: определение доступных аналитов, возможность использования новых аналитов, динамический ряд оценки, чувствительность метода, стоимость оборудования, цена расходных материалов. Все эти критерии следует учитывать при выборе метода исследования уровней цитокинов. Поскольку результаты определения биологически активных веществ в каждом методе могут существенно различаться, считается, что проводить статистический анализ данных, полученных с помощью разных методов, нецелесообразно. Для каждого отдельного исследования следует выбирать только одну какую-нибудь технологию для того, чтобы полученные данные и выводы были репрезентативными и соответствовали требованиям доказательной медицины. Измерение уровня одного какого-либо цитокина для характеристики различных процессов, протекающих в организме, является абсолютно недостаточным, так как не позволяет получить более или менее объективную информацию о комплексных биологических взаимодействиях на клеточном уровне как в норме, так и при патологии. В этой связи совершенно очевидно, что роль повышения или снижения уровня одного какого-либо цитокина в межклеточных взаимодействиях необходимо рассматривать с учетом изменения уровней других цитокинов, присутствующих в этом же исследуемом биологическом образце.
В табл. 19-5 приведен сравнительный анализ характеристик МИА и ИФА методов определения цитокинов.
ОГРАНИЧЕНИЯ И КРИТИЧЕСКИЕ МОМЕНТЫ В ОПРЕДЕЛЕНИИ ЦИТОКИНОВ С ПОМОЩЬЮ ОСНОВНЫХ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ.
В зависимости от задач клинической лабораторной диагностики цитокины определяют в различных биологических жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости, амниотической жидкости, в экссудатах, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, смывах, мокроте и др.). Особое внимание следует уделять условиям сбора и хранения биологических образцов, поскольку на этом этапе возможны грубые ошибки, которые в дальнейшем могут привести к неправильным результатам оценки и соответственно неверной интерпретации полученных данных. При повторных циклах размораживания-замораживания биопроб в результате действия протеиназ молекулы цитокинов подвержены разрушению. При неправильном сборе биологического материала не исключена возможность в условиях ех vivo освобождения цитокинов из клеток либо связывания их с клеточными рецепторами, что может повлиять на полученные результаты. Если центрифугирование крови для получения сыворотки не выполнить за короткий срок, на результаты оценки цитокинов может существенно повлиять способность тромбоцитов, как во время процесса свертывания крови, так и при центрифугировании, освобождать целый ряд цитокинов и хемокинов, включая IL-1, IL-6, CXCL8/IL8, CCL5/RANTES. При анализе цереброспинальной, амниотической, синовиальной, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, а также супернатантов клеток, перед замораживанием образцов необходимо избавиться от клеток. Связывание цитокинов с их растворимыми рецепторами также может повлиять на полученные результаты оценки уровней цитокинов в биопробах и не отразить истинную концентрацию цитокинов в анализируемых образцах. Этот эффект может происходить при специфическом связывании IL-1 и IL-6 с их растворимыми рецепторами. Не исключена возможность связывания цитокинов, например IL-1, IL-6, TNFα аутоантителами, что также может приводить к получению неверных, искаженных результатов.
При анализе уровней цитокинов в сыворотке и плазме крови наибольшее число ложноположительных результатов можно объяснить присутствием в этих биологических жидкостях гетерофильных антител. Эти антитела вырабатываются против неизвестных, недостаточно полно охарактеризованных антигенов и обычно обладают низкой авидностью. Такие низкоавидные антитела могут взаимодействовать с различными иммуноглобулинами и присутствуют у 40% здоровых лиц, а при различных аутоиммунных заболеваниях (например, у больных ревматоидным артритом) их количество существенно возрастает. Гетерофильные антитела могут включать антитела IgG, IgM и IgE и присутствуют в сыворотке и плазме крови, а также в других биологических жидкостях, в которых обычно проводится определение уровней цитокинов с помощью «сэндвич»-методов, используемых как в ИФА, так и в МИА-технологиях. Поскольку эти гетерофильные антитела могут связываться с компонентами иммуноаналитических систем, перекрестное связывание может приводить к ложноположительным результатам, реже — к ингибиции связывания (см. рис. 19-1). Для того чтобы исключить интерференцию с гетерофильными антителами, в настоящее время разработан ряд подходов. Поскольку гетерофильные антитела могут связываться с антителами разных видов животных, можно проводить преинкубацию образца со смесью сывороток разных видов животных, лишь после этого ставить методы оценки уровней цитокинов. Выбор сывороток животных зависит от используемых в тест-системах антител (антитела мыши, кролика, овцы и других животных). Однако при таком подходе возможны и другие осложнения: в смеси сывороток крови животных разных видов антитела могут взаимодействовать друг с другом, что может приводить к неэффективному связыванию с гетерофильными антителами человека в исследуемых образцах. Таким образом, этот подход имеет ограничения. У больных ревматоидным артритом или у детей с ювенильным идиопатическим артритом в сыворотке крови в больших количествах могут присутствовать IgM- и IgG-аутоантитела, в частности ревматоидный фактор. Существуют методы, позволяющие снизить уровни ревматоидного фактора в исследуемых образцах крови таких больных. Для этого используют протеин L. В противоположность протеину А или протеину G, этот протеин обладает способностью к высокоаффинному связыванию с IgM и IgG и меньшей аффинностью связывания с IgA. Гетерофильные антитела также могут взаимодействовать с компонентами супернатантов клеток, а именно с компонентами сыворотки крупного рогатого скота или аутологичной сыворотки человека, так как эти сыворотки обычно добавляют в культуральную среду, что способствует росту и дифференцировке культивируемых клеток.