Автор работы: Пользователь скрыл имя, 24 Октября 2014 в 18:17, реферат
Цитокины — эндогенные полипептидные и белковые медиаторы межклеточного взаимодействия, регулирующие эмбриональное развитие, некоторые нормальные физиологические функции организма, защитные реакции при внедрении патогенов и при развитии опухолей, формирование аллергических, аутоиммунных и иных иммунопатологических процессов и восстановление поврежденных тканей при травмах. Именно поэтому совершенно очевидно, что цитокиновая регуляция имеет огромное значение и в норме, и при патологии.
Время достижения равновесия на разных этапах анализа зависит от концентрации белков, например более низкое содержание белка может приводить к более высокой интенсивности люминесценции. Если определение цитокинов проводится в биологических жидкостях с высоким содержанием белка (например, в цереброспинальной жидкости, амниотической, синовиальной и других), стандартные кривые необходимо строить с использованием буфера с сопоставимым содержанием белка. Кроме концентрации белка, pH исследуемых образцов также может влиять на результаты анализа уровней цитокинов. Например, низкие уровни pH мочи могут приводить к конформации молекул цитокинов, причем некоторые молекулы менее устойчивы к таким изменениям среды (например, структура молекулы TNFα подвергается конформации при низких pH), в то время как молекулы других цитокинов (например, IFNg) остаются достаточно устойчивыми в широком диапазоне pH — от 4,8 до 9,5.
Существует определенная степень гомологии между молекулами антител и цитокиновыми молекулами, поэтому можно предположить, что при проведении анализа антитела могут распознавать не только молекулы цитокинов, но и другие белковые молекулы, присутствующие в биопробе. Причем при мультиплексном анализе, в котором используют очень большое число всевозможных антител, вероятность такого перекрестного связывания значительно выше, чем при ИФА.
Стандартные кривые и вычисления результатов.
Среди прочих факторов, влияющих на точность количественной оценки уровней цитокинов, важную роль играют используемые стандартные образцы и соответственно стандартные кривые. Обычно такие кривые состоят из серии определений с известными количествами рекомбинантных цитокинов (от 3 до 12 определений). В ИФА часто используют модель линейной регрессии. Если уровни исследуемых цитокинов находятся в пределах линейного ряда стандартной кривой, такая модель линейной регрессии является приемлемой для вычисления результатов. Однако, если полученные данные выходят за пределы линейной части стандартной кривой, образцы следует разбавлять и анализировать повторно, учитывая их разведение. Предел детекции в МИА ниже, чем в ИФА, даже если в обеих технологиях используются одни и те же пары антител, а динамический ряд измерения — шире. Более широкий динамический ряд определений (3-4-логарифмическая шкала) в МИА позволяет минимизировать число биологических проб, для которых необходимо проводить повторное определение уровней цитокинов (в ИФА обычно используют 1-2-логарифмическую шкалу). Поскольку ряд определений в стандартной кривой достаточно широк, линейная модель не всегда приемлема, и поэтому для вычисления уровней цитокинов в биопробах чаще используется нелинейная регрессионная модель.
Определение цитокинов в клинической практике.
Определение цитокинов в различных биологических жидкостях обычно используют для оценки активности воспаления, определения степени поляризации иммунного ответа, оценки эффективности проводимой терапии и прогноза заболевания. В ряде случаев уровни отдельных цитокинов могут коррелировать с тяжестью течения заболевания и прогнозом. Классическим примером может служить уровень интерлейкина-6 в плазме крови больных с тяжелыми травмами: высокие уровни IL-6 являются предикторами развития полиорганной недостаточности. Другим примером может служить определение высоких уровней IL-8 в цереброспинальной жидкости больных с лептоменингиальными метастазами солидных опухолей — как предиктора скорой гибели больного. Однако при большинстве заболеваний определение одного какого-либо цитокина обычно является совершенно недостаточным для диагностики или оценки прогноза заболевания. Для оценки состояния иммунной системы у таких больных необходимо определять достаточно большой спектр цитокинов, позволяющий оценить особенности цитокиновой регуляции в каждом конкретном компартменте. Благодаря сложным механизмам регуляции синтеза цитокинов, изменение экспрессии одного какого-либо цитокина обычно приводит к изменениям уровней других цитокинов. Причем скорость синтеза цитокинов может быть различной и зависит от целого ряда физиологических характеристик организма благодаря тесной кооперации трех основных адаптационных систем: нервной, эндокринной и иммунной. В этой связи определение различных цитокинов в биологических образцах лучше проводить одновременно, в мультиплексном режиме оценки, чтобы избежать возможных ошибок в интерпретации полученных данных.
Определение продукции цитокинов клетками.
Определение продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови in vitro как при стимуляции, так и без нее является альтернативой определения плазматического уровня цитокинов. Мононуклеары периферической крови служат в качестве удобной модели для оценки продукции цитокинов в основном из-за их доступности, при активации in vitro такими агентами, как фитогемагглютинин (ФГА) или бактериальный липополисахарид (ЛПС), мононуклеары периферической крови секретируют в культуральную среду целый спектр провоспалительных цитокинов: IL-1, IL-6, IL-8, TNF и другие. Измерение уровня цитокинов в биологических жидкостях дает возможность оценить уровень цитокинов, синтезированных клетками организма, в норме или при развитии патологии. Определение уровня цитокинов в супернатантах мононуклеаров периферической крови обеспечивает надежную оценку способности клеток продуцировать цитокины. Этот тест можно считать одним из важнейших методов оценки функционального состояния клеток иммунной системы. Он стоит в одном ряду с оценкой бластной трансформации лимфоцитов или определением фагоцитарной активности клеток. Определение синтеза цитокинов изолированными клетками в культуре может быть легко стандартизовано, так как в тесте используют стандартные препараты индукторов синтеза цитокинов, культуральные среды и другие реагенты, а сама оценка уровня цитокинов в культуральной среде может быть проведена как биологическими методами, так и стандартизованными иммуноферментными тест-системами, а также и их комбинациями. Более того, в супернатантах клеток, стимулированных одним либо двумя стандартными индукторами, может быть измерен одновременно целый ряд разнообразных цитокинов, позволяющих не только оценить общий уровень синтеза цитокинов индивидуума, но и определить цитокиновые профили, например поляризацию Т-хелперных клонов по характерному профилю синтезируемых цитокинов, соотношение синтеза агонистов и антагонистов и т.д. Кроме того, в культуре клеток можно оценить синтез цитокинов в ответ на специфический антиген, что может иметь неоценимое значение в диагностике силы и развития иммунного ответа при ряде инфекционных заболеваний, при вакцинации, аллергической сенсибилизации и других патологических состояниях, в культуре имеется возможность определения продукции цитокинов у предварительно криоконсервированных клеток, полученных либо от разных доноров, либо в разное время и собранных вместе для более удобного, экономичного и надежного серийного мониторинга при клинических испытаниях. Методика определения синтеза цитокинов изолированными клетками достаточно проста и заключается в следующем. Свежую венозную кровь, взятую в емкость с гепарином (20 МЕ/мл), тщательно перемешивают и разводят в 5 раз средой RPMI 1640 с добавлением 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина, обычно к 0,6 мл крови добавляют 2,4 мл среды RPMI1640. В качестве индуктора синтеза группы провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF), IL-10, IFNα и хемокинов могут быть использованы препараты ЛПС в концентрации 1-10 мкг/ мл, например отечественный ЛПС-содержащий препарат продигиозан*. В качестве индукторов синтеза IL-2, IL-4, IFNg и других Т-клеточных цитокинов может быть использован ФГА-М (Sigma*) в конечной концентрации 50 мкг/мл. ФГА является универсальным индуктором и может быть использован также и для индукции синтеза провоспалительных цитокинов. В 96-луночный планшет для культивирования клеток («COSTAR» или аналогичный) вносят индуктор по 100 мкл на лунку, в контрольные лунки (для оценки спонтанной продукции) вносят по 100 мкл среды RPMI 1640, затем во все лунки добавляли по 100 мкл разведенной, как описано выше, крови. Культивирование проводят при 37 °С в 5% СО2 в течение 24 ч, после чего осторожно отбирают супернатанты и проводят исследование содержания цитокинов в биологическом или иммуноферментном тесте, у больных подсчитывают количество лейкоцитов и формулу крови по стандартным методикам. Полученные данные о концентрациях цитокинов в супернатантах пересчитывают на 1 млн лейкоцитов либо мононуклеаров, лимфоцитов или других интересующих клеток в 1 мл с учетом произведенных разведений крови. При необходимости супернатанты могут храниться при -20 °С до 6 мес при однократном замораживании. Многие провоспалительные цитокины в норме не должны циркулировать в крови. Тем не менее описаны случаи увеличения уровней провоспалительных цитокинов, в частности IL-1, в плазме крови при стрессовых ситуациях и тяжелой физической нагрузке. По-видимому, присутствие невысоких уровней этих цитокинов в плазме крови здоровых доноров можно объяснить следующими причинами. Во-первых, они могут появляться в циркуляции в результате некоторых нормальных физиологических процессов жизнедеятельности организма, либо под влиянием стрессорных факторов неинфекционной природы. Во-вторых, в ряде случаев данные уровни цитокинов могут являться проявлением вяло текущих скрытых воспалительных процессов, а также иммунопатологических состояний, включая ранние стадии аутоиммунных и аллергических заболеваний еще до появления клинических проявлений. Наконец, ряд цитокинов в плазме крови могут быть связаны с белками переносчиками и различными ингибиторами. При этом цитокины могут не обладать биологической активностью, но выявляться иммунохимически с помощью специфических антител. Определение уровней цитокинов в сыворотке крови имеет ряд сложностей из-за наличия неспецифических факторов связывания, которыми являются различные сывороточные белки. Цитокины IL-1, IL-2 и другие могут взаимодействовать с α2-макроглобулином, образуя комплексы, которые могут маскировать иммунореактивность цитокинов. Наряду с неспецифическим связыванием существует и специфическое. Уровни цитокинов, измеренные иммуноферментным методом, могут быть неинформативными из-за присутствия растворимых рецепторов для цитокинов. В этих случаях специфическое взаимодействие цитокина с рецептором ведет к кажущемуся исчезновению его из крови. Циркулирующие аутоантитела к цитокинам являются другими специфическими ингибиторами, присутствующими в сыворотке некоторых индивидуумов, например у лиц, получавших цитокиновую терапию. Уровни цитокинов в плазме периферической крови отражают текущее состояние работы иммунной системы и развития защитных реакций, то есть синтез цитокинов клетками организма in vivo. Определение уровней продукции цитокинов изолированными клетками in vitro показывает их функциональное состояние. Спонтанная продукция цитокинов в культуре свидетельствует о том, что клетки уже активированы in vivo в результате развития воспаления или иммунопатологических процессов. В то же время активация клеток может произойти вследствие манипуляций в процессе выделения. Иногда это происходит из-за несоблюдения стерильности при заборе крови или при использовании культуральных сред и растворов реагентов, загрязненных ЛПС. Индуцированная продукция цитокинов позволяет оценить потенциальные возможности активации клеток, что очень важно для оценки иммунологической реактивности. Сниженная индуцированная продукция цитокинов in vitro может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния. Именно поэтому оба варианта изучения уровней цитокинов в циркуляции либо продукции лейкоцитами важны с точки зрения характеристики работы иммунной системы.
Преимущество метода индукции синтеза цитокинов в культурах цельной крови имеет ряд преимуществ по сравнению с индукцией цитокинов в культурах клеток, выделенных на градиенте плотности. В первую очередь это простота и связанная с этим более высокая степень стандартизации процедуры. Во-вторых, стимуляция клеток происходит в присутствии собственной плазмы и лучше отвечает задаче наиболее полного воспроизведения условий синтеза цитокинов в организме. Тем не менее в ряде случаев разделение клеток на фракции позволяет более точно определить продукцию цитокинов определенными популяциями лимфоцитов, моноцитов или гранулоцитов.
В этой связи одним из наиболее перспективных современных методов анализа продукции цитокинов изолированными клетками является метод ELISPOT, представляющий собой своеобразный гибрид метода индукции синтеза цитокинов в культуре и обычного иммуноферментного анализа. Суть метода заключается в том, что выделенные клетки культивируют в присутствии индуктора синтеза цитокинов в микропланшетах, дно которых покрыто антителами к интересующему цитокину, как это делается на первом этапе ИФА. В процессе культивирования клетки, находящиеся на дне планшета, синтезируют цитокины, которые тут же связываются с сорбированными на пластике антителами. Таким образом, оказывается, что цитокин соединяется с сорбированными антителами в тех местах, где его синтезировали клетки. Дальнейшие этапы анализа проводятся, как в стандартном варианте ИФА, с той лишь разницей, что при постановке ELISPOT используется нерастворимый цветной субстрат ферментативной реакции, выпадающий в осадок там, где цитокин связался с сорбированными антителами. В результате на дне планшета образуются окрашенные пятна, соответствующие местам, где происходил синтез цитокинов клетками. Отсюда и произошло название метода — ELISPOT как комбинация метода ELISA с конечным формированием окрашенного пятна (spot). Пятна легко видны под малым увеличением микроскопа, их количество относительно исходного числа клеток и разный размер позволяют оценить интенсивность синтеза цитокинов на уровне отдельных клеток. В настоящее время разработаны варианты метода с использованием субстратов разных цветов для оценки синтеза 2-3 цитокинов одновременно и созданы приборы для автоматического подсчета и анализа размеров пятен, что очень важно для стандартизации метода ELISPOT. Наиболее точную характеристику отдельных клеток, продуцирующих цитокины, дает метод цитоплазматического окрашивания цитокинов в варианте цитофлюо- риметрического анализа. Мембранные формы цитокинов и рецепторы цитокинов легко определяют на поверхности клеток с помощью меченных флюорохромами антител в обычном варианте цитофлюориметрии аналогично другим поверхностным молекулам клеток. Для выявления цитоплазматических цитокинов требуется достижение состояния проницаемости или пермебиализация мембран для обеспечения проникновения антител в клетки. Для этой цели используется сапонин в сочетании с блокаторами обратного транспорта (брефелдин А или монензин) для предотвращения экскреции антител из цитоплазмы клеток. Метод выгодно отличается от метода ELISPOT возможностью дополнительной характеристики клеток по размеру и экспрессии мембранных маркеров, что позволяет проводить более точную идентификацию цитокин-продуцирующих клеток. Рецепторы цитокинов представляют собой трансмембранные белки, а некоторые цитокины могут существовать в виде мембранной формы. В обоих случаях экстраклеточные домены цитокинов и их рецепторов представляют собой поверхностные антигенные детерминанты различных клеток человека. Мембранные рецепторы и мембранные формы цитокинов, распознаваемые соответствующими моноклональными антителами, включены в единую классификацию поверхностных молекул клеток (СD) и получили свои порядковые номера (табл. 19-6), Это позволяет изучать количество и типы клеток, экспрессирующих рецепторы и мембранные формы цитокинов, с помощью цитофлюориметрии, а также использовать клеточные сортеры для выделения клеток, имеющих на мембранах определенные типы цитокинов или их рецепторов.
Определение уровней цитокинов в тканях.
Несмотря на то, что определение уровня цитокинов в сыворотке или плазме является более простым в исполнении, определение уровня цитокинов в тканях может дать дополнительную информацию о состоянии местного иммунитета. Так как цитокины — это локальные медиаторы, то методы определения уровня цитокинов в месте воспаления или органного повреждения и репарации могут быть более биологически значимыми, чем определение их уровня в периферической крови. Однако все эти методы требуют получения биопсии ткани и являются трудоемкими. Простейший подход — это диссоциация ткани и приготовление тканевого экстракта, который затем тестируется методом ИФА. Однако этот метод не дает информации о том, какие клетки продуцируют цитокины и где они локализованы в ткани. Кроме того, для корректной интерпретации результатов требуется нормальная ткань в качестве контроля.
Иммуногистохимический метод.
Широко распространенными методами детекции цитокинов в тканях являются иммуногистохимические методы с использованием специфических поликлональных или моноклональных антител к цитокинам. С помощью этих методов цитокины могут быть обнаружены в цитоплазме клеток — в мазках клеточных суспензий, приготовленных разными способами на предметных стеклах в виде обычного гематологического мазка, с помощью цитоцентрифуги, способом тонкой капли и другими методами. Кусочки тканей, полученные с помощью биопсии или во время операции, обычно глубоко замораживают в жидком азоте, а затем готовят срезы толщиной 4-6 мкм в криостате при температуре -20 °С. Приготовленные и высушенные мазки или срезы тканей фиксируют этанолом, метанолом или параформальдегидом (4% раствор в натрий-фосфатном буфере, pH 7,2-7,4) 20 мин при +4 °С, затем отмывают в PBS (pH 7,2-7,4), в течение 10 мин, высушивают и хранят при +4 °С до проведения реакции. Чаще всего изучение локализации цитокинов в клетках проводят методом непрямой иммуногистохимии с использованием специфических антител к цитокинам, а на втором этапе — антивидовых антител, меченных флюорохромами для люминесцентной микроскопии или ферментами для световой микроскопии. Важно, что в случае флюоресцентных меток антитела к цитокинам могут быть использованы для их выявления с помощью цитофлюориметра, причем в данном варианте возможно выявление как цитоплазматических цитокинов, так и их мембранных форм. В случае ферментов используют биотинилированные антивидовые антитела, а на последнем этапе комплексы стрептавидин-пероксидаза либо стрептавидин-щелочная фосфатаза. При проведении цветной реакции применяют нерастворимые субстраты, выпадающие в осадок в месте взаимодействия антител с цитокинами, то есть в месте локализации цитокинов в клетках. В случае световой микроскопии препараты могут быть докрашены гематоксилином и некоторыми другими красителями, что позволяет достаточно хорошо различать структуру ткани. Кроме того, существуют методы иммуногистохимического выявления отдельных цитокинов на парафиновых срезах, дающих наиболее полное сохранение морфологической структуры исследуемых тканей.
Молекулярно-биологические методы изучения цитокинов.
Определение экспрессии генов цитокинов в клетках-продуцентах по накоплению мРНК служит еще одним подходом к оценке их синтеза. Появление мРНК в клетках или тканях обычно детектируется путем гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами, длина которых варьирует от нескольких нуклеотидов до целой кДНК, соответствующей гену искомого цитокина. Эти зонды содержат радиоактивные, флюоресцентные или ферментные метки, в зависимости от метки применяют соответствующий метод для выявления тканевой локализации мРНК. При использовании метода гибридизации in situ на свежих криосрезах тканей или мазках клеток для выявления локализации мРНК цитокинов могут использовать комплементарные РНК зонды для РНК-РНК гибридизации. Метод позволяет определять количество и тип клеток, экспрессирующих цитокины. Недостатком метода является тот факт, что в ряде случаев наличие мРНК совсем необязательно отражает присутствие соответствующего полипептида цитокина в клетке: процессы транскрипции и трансляции могут регулироваться независимо. Накопление большого количества мРНК может не сопровождаться последовательным синтезом белка. Если мРНК не транслируется, что часто бывает при ряде патологических состояний, то искомый цитокин будет отсутствовать. Кроме того, возможно появление различных изоформ мРНК в результате альтернативного сплайсинга. Таким образом, для получения более полной информации о содержании цитокинов в тканях необходимо, видимо, использовать комбинацию методов, позволяющих оценить как экспрессию мРНК, так и синтез данного цитокина в клетке.
Новейшим количественным методом для определения цитокиновой мРНК является метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR). Этот метод отличается очень высокой чувствительностью и специфичностью, как и все тесты, основанные на методике ПЦР. В настоящее время разработаны многие модификации метода, такие как ПЦР в реальном времени (real-time PCR), микрочипы (microarray), позволяющие анализировать одновременно несколько сотен генов, и другие. Гибридизация с олигонуклеотидными зондами, комплементарными участкам единичных нуклеотидных замен в генах цитокинов, с использованием амплификации методом ПЦР применяется и для анализа аллельного полиморфизма. Одной из последних разработок является использование аптамеров — олигонуклеотидов, полученных по технологии SELEX, для количественной оценки уровней цитокинов. Существует модификация ИФА, где вместо антител в качестве распознающих цитокины молекул используются аптамеры.
Мутации генов цитокинов и регуляторных молекул в большинстве случаев приводят к снижению функциональной активности цитокинов и нарушению развития защитных реакций организма. Наследственные нарушения в системе цитокиновой регуляции затрагивают многие ключевые медиаторы и их рецепторы, приводя к тяжелым клиническим проявлениям разнообразных видов иммунодефицитных состояний. В то же время отдельные мутации могут приводить к повышенному синтезу цитокинов либо нарушению регуляторных взаимодействий в цитокиновой сети и к возникновению связанных с этим аутоиммунных, аутовоспалительных и лимфопролиферативных состояний.