Биотехнология получения аминокислот

Исключительно микробиологическим синтезом получают аминокислоту — глутаминовую, которая используется в виде мононатриевой соли (МНГ) в качестве вкусовой добавки. Так, только в США в качестве вкусовых добавок ежегодно потребляется 30 000 т МНГ.

Важной особенностью глутаминовой кислоты является способность служить защитным фактором при различных отравлениях печени и почек, усиливать фармакологическое действие одних и ослаблять токсичность других лечебных средств. Глутамат натрия способствует длительному сохранению вкусовых качеств консервированных продуктов. Это определило широкое использование глутамата натрия в консервной промышленности при консервировании овощей, рыбы. Он повышает деятельность пищеварительных желез.

Ведущее место в производстве глутамата занимают Япония и США. Япония обладает практически всеми патентами, описывающими производство 20 аминокислот, получаемых в основном с помощью микробной ферментации.

При сравнительной оценке разных способов производства глутаминовой кислоты наиболее перспективным является микробиологический синтез. Впервые о возможности получения L-глутаминовой кислоты непосредственно из углеводов с помощью микроорганизмов методом глубинного культивирования стало известно из работ японских ученых Киноситы, Асаи и других в 1957 г.

Способность аккумулировать в среде для культивирования аминокислоты обнаружена у многих микроорганизмов. Они относятся к разным таксономическим группам. Среди культур, являющихся потенциальными продуцентами глутаминовой кислоты, обнаружено 20% бактерий, 30% стрептомицетов, 30% дрожжей, 10% микроскопических грибов. Строгой корреляции между видовой принадлежностью организма и его способностью накапливать аминокислоты нет. Важным требованием к продуцентам аминокислот является способность продуцировать преимущественно одну аминокислоту.

Первыми продуцентами глутаминовой аминокислоты были микрококк Micrococcus glutamicus и коринебактерии Corynebacterium glutamicus. Оба продуцента получены в результате обработки ультрафиолетовыми лучами, являются ауксотрофами и нуждаются в биотине и интенсивной аэрации. Эти штаммы накапливают до 30 мг/мл глутаминовой кислоты.

Наиболее перспективными в промышленности аминокислот есть и будут ауксотрофы. Самыми распространенными продуцентами являются бактериальные культуры, относящиеся к родам Вгеvibacterium, Micrococcus, Microbacterium, Corynebacterium, Arthrobacter. Это грамположительные бактерии, палочковидные, неподвижные, не спорообразующие. Отличительной особенностью бактерий-продуцентов является их обязательная потребность в биотине либо в биотине и тиамине. Аминокислоты секретируются в среду. Продуцентами глутаминовой кислоты являются бактерии, которые синтезируют глутаминовую кислоту с выходом не меньше 40% от исходного сахара или другого сырья.

Сырьем для производства глутаминовой кислоты, кроме углеводов, могут быть различные углеводороды, начиная от природных метана и этана и кончая н-парафинами или ароматическими соединениями (бензиловый спирт, пирокатехин и пр.). Могут быть также использованы и другие соединения.

Успех промышленного производства МНГ зависит от того, удастся ли заставить клетку секретировать продукт в больших количествах. Считают, что один из путей для достижения этой цели состоит в выращивании продуцента в питательной среде, содержащей пониженное количество биотина. В таких условиях мембрана клетки становится более проницаемой для МНГ. Аналогичный эффект достигается добавкой в среду жирной кислоты, детергента или пенициллина. Последний тормозит синтез пептидогликана клеточной стенки.

Глутаминовая кислота. Некоторые дикие штаммы коринебактерий, называемые глутаминовыми, могут образовать более 30 г/л глутаминовой кислоты и выделяют ее в среду. Вышеуказанные штаммы требовали биотин и имели очень слабую активность -кетоглутаратдегидрогеназного комплекса.

Под действием этого комплекса - кетоглутаровая кислота превращается в янтарную и уводится как субстрат восстановительного аминирования (рис. ).

В связи с дефицитом ЦТК (вследствие удаления -кетоглутаровой кислоты) работает глиоксилатный шунт и имеется конкуренция за изоцитрат. В процессе роста изоцитрат необходим для получения энергии и протекания биосинтетических реакций. Следовательно, оптимальные условия для роста и. образования глутаминовой кислоты различны (рис. ).

Синтез глутаминовой кислоты происходит в результате ферментативного восстановительного аминирования - кетоглутаровой кислоты за счет НАД- и НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы.

 

Для регуляции проницаемости мембраны в отношении L-глутаминовой кислоты используют потребность клеток в биотине.

Являясь кофактором ацетил-КоА-карбоксилазы, биотин участвует в синтезе жирных кислот — компонентов фосфолипидов мембраны. Если клетки выращивать при субоптимальной концентрации биотина (2,5—5,0 мкг/л), то нарушается правильное соотношение насыщенных к ненасыщенным жирным кислотам и синтезируется дефектная мембрана, пропускающая через себя молекулы глутаминовой кислоты.

Некоторые дикие штаммы коринебактерий, называемые глутаминовыми, могут образовать и выделить в среду более 30 г/л глутамата. Они являются ауксотрофами (необходим биотин) и имеют очень слабую активность - кетоглутаратдегидрогеназы, которая катализирует превращение глутамата в янтарную кислоту в ЦТК. 3 связи с дефицитом - кетоглутарата у продуцентов этой аминокислоты работает глиоксилатный шунт (рис. 1).

 

 

                              Рис.1. Цикл глиоксилевои кислоты (глиоксилатныи цикл)

 

 

 

 

Рис.2. Схема биосинтеза глутаминовой кислоты микроорганизмами продуцентами.

 

 

 

 

 

Таким образом, сверхпродукция глутаминовой кислоты связана с отсутствием или низкой активностью а-кетоглутаратдегидрогеназы (во-первых), высокой активностью НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (во-вторых) и изменением проницаемости клеточной мембраны в сторону повышения этой способности для глутамата (в-третьих). Исследование ферментных систем цикла Кребса у продуцентов глутаминовой кислоты показало, что у них работают все ферменты цикла, кроме -кетоглутаратдегидрогеназы, которая участвует в превращении -кетоглутарата в сукцинил — КоА (см. рис. 2).

Существенной чертой метаболизма продуцентов глутамата является также низкая активность НАДФН2-терминальной оксидазной системы, которая окисляет глутаминовую кислоту, что позволяет почти полностью сохранить синтезированную аминокислоту.

При организации микробиологического способа получения глутамата на первых этапах использовали трансформацию - кетоглутарата за счет ферментных систем продуцента. В ферментационную среду вводили соль аммония, -кетоглутарат или его соль, буфер с оптимальным значением рН реакции, культуру микроорганизмов. Однако метод оказался нежизнеспособным. Кофермент чрезвычайно быстро исчезал из сферы реакции, искусственное внесение его в среду слишком дорого. Так произошло вытеснение метода трансформации полной микробной ферментацией глутаминовой кислоты.

2.1.Технология получения L-глутаминовой кислоты микробиологическим синтезом

Глутаминовая кислота ( -аминоглутаровая) имеет структурную формулу

НООС—СН2–СН2—СН—СООН

                         |  

                      NH2

В значительном количестве входит в состав растительных и животных белков. Не относится к числу незаменимых, однако на ее основе осуществляется синтез многих физиологически активных соединений, необходимых для нормальной жизнедеятельности организма человека.

Находит широкое применение в пищевой промышленности и медицине при лечении заболеваний, связанных с отравлением печени и почек. В виде глутамата натрия (мононатриевая соль глутаминовой кислоты)  применяется как добавка в пищу для усиления вкусовых качеств приготовленных продуктов питания и сохранения их в изделиях, предназначенных для длительного хранения, в частности в консервированном и замороженном состоянии.

В промышленности глутаминовую кислоту и на ее основе глутамат натрия получают несколькими способами: многостадийным химическим синтезом из акрилонитрила, микробиологическим синтезом по одноступенчатой и двухступенчатой технологии, выделением из свекловичной мелассы или из белковых гидролизатов. Наибольшее распространение получили способы выделения глутаминовой кислоты из свекловичной мелассы и одноступенчатого микробиологического синтеза. Последний считается самым перспективным.

В промышленном биосинтезе L-глутаминовой кислоты используются те же микроорганизмы, что и в микробиологическом производстве L-лизина, т. е. Coryn. glutamicum и Brev. flavum. Кроме них, промышленными продуцентами могут быть некоторые штаммы бактерии Micrococcus и Microbacterium.

Для осуществления процесса биосинтеза глутаминовой кислоты с высоким выходом используют мутанты с нарушенной ферментативной системой превращения а-кетоглутаровой кислоты в янтарную. При этом, если культура обладает недостаточностью по биосинтезу аланиндегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, то выход глутаминовой кислоты будет увеличиваться за счет отсутствия расхода углеводов среды на биосинтез аланина и молочной кислоты.

При промышленном культивировании в качестве источника углерода используют легкоассимилируемые углеводы (сахарозу и глюкозу), содержащиеся в свекловичной мелассе, гидроле, гидролизатах крахмала. Источником азота являются мочевина, реже хлорид и сульфат аммония, кукурузный экстракт, причем последний применяют только на стадиях получения инокулята и посевного материала, в основном по причине большого содержания в нем биотина. Повышенное содержание биотина в мелассе также может ограничить использование ее как основного источника сырья для биосинтеза.

Все продуценты глутаминовой кислоты биотинзависимые, а некоторые из них и тиаминзависимые, однако содержание биотина регламентировано и не должно превышать 2—5 мкг на 1 л среды. Более высокая концентрация этого витамина излишне стимулирует рост клеток продуцента, способствует повышенному образованию, аланина, молочной, янтарной, аспарагиновой кислот, а выход глутаминовой кислоты при этом значительно снижается.

Ингибирующее влияние биотина удается снизить при включении в состав питательных сред различных добавок в виде некоторых спиртов, ПАВ, антибиотиков (пенициллинов, тетрациклинов). Добавки в среду ПАВ в количестве 0,01—0,2% или калиевой соли бензилпенициллина (4—6 тыс. ед. на 1 л среды) повышают биосинтетическую способность продуцента на 15— 45% и выход глутаминовой кислоты достигает 50 г/л. Действие антибиотиков, по-видимому, связано с ингибированием синтеза липогликопротеинового комплекса клеточной оболочки продуцента, что приводит к увеличению проницаемости клеточных мембран для глутам.иновой кислоты.

В зависимости от особенностей используемого штамма количество азота в виде мочевины, включаемого в питательные среды для осуществления процесса биосинтеза, составляет 1,0—2,0%. Для создания оптимальных условий биосинтеза и увеличения количества производимой глутаминовой кислоты в единице объема культуральной жидкости процесс по завершению накопления основной массы клеток проводят с подпиткой раствором мочевины. Содержание ее в культуральной жидкости не должно превышать 0,8%, а рН раствора должно быть в пределах 6,8—7,8. Недостаток азота в среде снижает выход глутаминовой кислоты, способствуя накоплению повышенных количеств - кетоглутаровой кислоты.

2.1.1. Одноступенчатый способ получения.

Принципиальная техно.логическая схема культивирования продуцента и биосинтеза глутаминовой кислоты практически полностью повторяет схему микробиологического производства L-лизина. Поэтому будут рассмотрены только некоторые отличия, наблюдаемые на стадиях культивирования продуцента и проведения биосинтеза.

Посевной материал на каждой из стадии его получения (от пробирок до посевного аппарата) выращивают в строго асептических условиях по 24 ч. Состав питательных сред незначительно меняется при переходе от одного штамма к другому и практически остается постоянным на каждой из промежуточных стадий получения посевного материала. Только при выращивании продуцента в посевном аппарате в питательную среду вносят до 0,1% стерильного синтетического пеногасителя.

Для промышленных штаммов Coryn. glutamicum питательные-среды при производстве посевного материала, как правило, содержат следующие компоненты (в %):

Меласса ………….8               Сульфат магния…………….0,03

Кукурузный экстракт………0,3              Вода…………………..остальное

Хлорид   аммония………….0,5              pH среды………………….7,0–7,2

Калия фосфат двухзамещенный 0,05

Питательные среды на стадии биосинтеза содержат те же компоненты и в том же количестве, только вместо кукурузного экстракта и сульфата аммония присутствует до 2% мочевины, содержание мелассы увеличивают до 20%, дополнительно вводят мел до 1% и 0,1% синтетического пеногасителя.

Накопление биомассы до 6—8 г АСВ на 1 л среды производят в аэробных условиях сначала в инокуляторах объемом 2 м3, потом в посевных аппаратах объемом 5 м3. Полученный посевной материал в количестве 5—6% (от объема среды производственных аппаратов стерильно передают в основные ферментаторы.

Процесс биосинтеза осуществляют в строго асептических условиях в ферментаторах объемом 50 м3 с коэффициентом заполнения аппарата 0,7 в течение 48—52 ч и интенсивной аэрации [80—85 мг О2/(л-мин)], что соответствует расходу 1 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне 28—30°С. В конце процесса биосинтеза готовая культуральная жидкость содержит до 45 г/л глутаминовой кислоты. Выход глутаминовой кислоты по отношению к потребленным сахарам составляет 45— 50%.

Поскольку производство глутаминовой кислоты направлено на получение высокоочищенных препаратов, последующая технологическая схема предусматривает производство продуктов, подготовленных непосредственно к применению в качестве пищевых добавок и в виде лекарственных форм.

Выделение глутаминовой кислоты из культуральной жидкости и последующая очистка ее в соответствии с требованиями фармакопеи предполагает такую последовательность проведения технологических операций.