Биотехнология получения аминокислот

Предварительная обработка культуральной жидкости. Осуществляется в результате добавления к ней определенного количества негашеной извести (или известкового молока) с последующим осаждением избытка ионов кальция фосфорной кислотой. Образующийся при этом осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей.

Отделение осадка. Проводят центрифугированием или фильтрованием под давлением.

Осветление фильтрата. Состоит в очистке его от пигментных примесей, окрашивающих нативный раствор в темный цвет. Для этого обрабатывают фильтрат активированным углем или подвергают его ионообменной сорбции на анионите ИА-1.

Концентрирование осветленного раствора глутаминовой кислоты. Проводят путем его вакуум-выпаривания при температуре 40—60°С, при этом из исходного раствора глутаминовой кислоты отгоняют от 50 до 80% воды.

Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты в изоэлектрической точке. Эта стадия осуществляется путем подкисления полученного на предыдущем этапе концентрата соляной кислотой до рН 3,2 (изоэлектрическая точка глутаминовой кислоты) и охлаждения раствора до 4—15°С. Однократное проведение операции обеспечивает кристаллизацию 77% глутаминовой кислоты;

при повторном ее проведении выход возрастает до 87%. Чистота получаемых кристаллов достигает 88%.

В результате последующей перекристаллизации чистоту получаемых кристаллов можно увеличить до 99,6%, что удовлетворяет требованиям фармакопеи.

Отделение кристаллов глутаминовой кислоты от маточника. Это достигается центрифугированием с последующей декантацией и возвратом маточника на стадию вакуум-выпаривания. Полученные кристаллы промывают обессоленной водой и направляют на сушку.

Сушка кристаллов глутаминовой кислоты. Проводится в вакууме или в токе нагретого воздуха при 60—70°С.

 

 

                                 Рис.3. Схема биосинтеза глутаминовой кислоты

Схема ее производства имеет много общего со схемой производства лизина. Существенные различия заключаются в свойствах микроорганизмов-продуцентов, условиях их культивирования, составе среды, очистке целевого продукта.

При ферментации глутаминовой кислоты источником углерода могут быть глюкоза, крахмал, меласса, углеводороды, этанол, метанол, уксусная кислота. Источник азота — соли аммония: NH4C1, (NH4)2SO4 или мочевина (1,5—2%). Концентрация углеводов — до 5—10%. Из витаминов необходимы тиамин и биотин в концентрации до 5 мкг/л питательной среды. При использовании в качестве сырья мелассы основная трудность процесса заключается в снижении высокого содержания биотина. Тогда в ферментационную среду вводят ингибиторы биотина или поверхностно-активные вещества (ПАВ). Таким методом культура Microbacterium ammoniophilum на среде с тростниковой мелассой дала выход глутаминовой кислоты более 70 г/л.

Действие избытка биотина в среде снимают антибиотиками (пенициллин, тетрациклин, окситетрациклин). Через 4—5 ч от начала культивирования вводят 2—3 ед. / мл среды пенициллина, изменяющего проницаемость мембраны клетки. Нарушается синтез мембраны. Образующиеся протопласты продуцента Brevibacterium sp.-22 обладают высокой биосинтетической активностью, превращая до 89% потребленного сахара в глутаминовую кислоту.

В Институте микробиологии Латвии разработан метод получения глутаминовой кислоты с использованием культуры Micrococcus glutamicus.

Принцип его в следующем. Культуру продуцента размножают в лаборатории — в пробирках, колбах на качалке. Выращивание проводят при 28—30°С, рН 6,8—7,5 в течение 24 ч. Инокулят для производства готовят в аэробных условиях на среде такого же состава, как и на первых этапах работы с посевной культурой %: сахароза — 5, мочевина—1, меласса— 1,5, сульфат Mg — 0,1, одно- и двузамещенного фосфата калия — 0,1. Инокулят готовят в ферментаторах емкостью 2 и 5 м3 до получения 6—8 г/л сухой биомассы и вносят в ферментаторы на 50 м3, как правило, 5—6% от объема среды.

Условия производственной ферментации: интенсивность аэрации 40—45 мг О2 л/мин, рН 7,8—8,0, температура — 28—30° С, продолжительность — 48 ч. В среде накапливается до 50 г/л глутаминовой кислоты.

По окончании процесса биомассу отделяют от культуральной жидкости фильтрованием. Глутаминовую кислоту выделяют из фильтрата сорбцией на смоле КУ-2 в NH4+-форме. Сорбционная емкость смолы — 0,08—0,1 г глутаминовой кислоты на 1 г абсолютно сухого катионита. После промывки колонки 0,001 Н серной кислотой элюцию проводят 0,2 Н раствором аммиака. Выход глутаминовой кислоты на стадии элюции составляет более 99%.

Элюаты обрабатывают активным углем и сгущают под вакуумом при 40°С в 3—5 раз. Подкисляют соляной кислотой до рН 3,2 при 4° С, после чего выкристаллизовывалось около 77% глутаминовой кислоты. Повторная обработка маточника повышала выход продукта до 87%, чистота получаемых кристаллов составляла 99,2%. После перекристаллизации чистота повышается до 99,6%, что удовлетворяет требованиям.

2.1.2. Двухступенчатый способ получения.

Его возможно осуществить из -кетоглутаровой кислоты с помощью ферментов трансамилазы или глутаматдегидрогеназы в результате следующих превращений:

I вариант — переаминирование аминокислот

а-кетоглутаровая кислота + аминокислота трансамидаза___________►

►L-глутаминовая кислота + а-кетокислота;

II вариант — восстановительное аминирование

а-кетоглутаровая КИСЛОТа + NH + НАДН глутаматдегидрогеназа___►

►L,-глутаминовая кислота + Н2О -+- НАД+

В каждом из этих процессов - кетоглутаровая кислота играет роль предшественника. Для осуществления любого из этих превращений необходимы источники - кетоглутаровой кислоты и соответствующей ферментной системы. Первую из этих задач решают с помощью подбора микроорганизмов, способных продуцировать значительное количество -кетоглутаровой кислоты из доступных источников сырья. Продуцентами -кетоглутаровой кислоты могут быть Pseudomonas и Escherichia, а при культивировании продуцента Kluyverd citrophila -кетоглутаровая кислота была получена с 57%-ным выходом. Дрожжи рода Candida при выращивании на н-парафинах продуцируют - кетоглутаровую кислоту совместно с пировиноградной в соотношении 6:1. Экономический коэффициент процесса биосинтеза достигает 90% от количества потребленных углеводородов.

В роли продуцента фермента трансамидазы могут выступать различные микроорганизмы, например Е. coli. Донором аминогрупп может быть аспарагиновая кислота или аланин.

Восстановительное аминирование возможно осуществить с помощью Pseudomonas (при использовании Ps. ovalis выход L-глутаминовой кислоты составляет 60%) или Aeromonas, причем некоторые штаммы этих микроорганизмов в качестве субстрата могут использовать D-L- -оксиглутаровую кислоту, производимую химическим синтезом.

Глутамат натрия. НООС—СН2—СН2—CH(NH2)—COONa-H20 получают из технической глутаминовой кислоты; водный раствор ее обрабатывают до полного обесцвечивания активным углем (t— 60—70°С), обработку проводят при рН 6,8—6,85 в присутствии NaOH, по окончании обработки раствор фильтруют. Затем проводят упаривание под вакуумом при 40—50°С до содержания 60% сухих веществ и передают на кристаллизацию. Ее проводят в течение 3 сут. при плавном снижении температуры. Кристаллы глутамата натрия отделяют от маточного раствора на центрифуге и высушивают нагретым воздухом до остаточной влажности 0,05—0,1%.

На выпускаемый промышленностью глутамат натрия разработаны и действуют МРТУ 18/210—68. В соответствии с их требованиями глутамат натрия пищевой должен иметь следующий состав, %:

общий азот         —	не	менее	7,02
основное вещество —		»	94,00
хлористый натрий —	не	более	5,00
влага                  —		»	1,00

В связи с расширением объема производства ведется непрерывный поиск новых видов сырья. Доказана возможность использования сахара-сырца, гидролизатов торфа, крахмала, целлолигнина как источников углерода. В качестве дефицитных факторов роста и органического азота предлагается использование гидролизатов и автолизатов дрожжей, картофельного сока, экстракта отрубей, альбуминного молока и других веществ.

Получение глутамата натрия НООССН2СН2СН (NH2) COONa • Н2О). Процесс осуществляется обработкой влажных кристаллов неперекристаллизованной глутаминовой кислоты гидрокси-дом натрия. Для этого влажные кристаллы растворяют в определенном количестве воды и нейтрализуют 45—50%-ным раствором едкого натра, рН раствора доводят до 6,8, после чего его фильтруют. Осветленный раствор глутамата натрия упаривают под вакуумом до содержания сухих веществ около 60% и передают на кристаллизацию. Ее проводят в течение трех суток при постепенном снижении температуры. Кристаллы глутамата натрия отделяют от маточного раствора центрифугированием и сушат в токе горячего воздуха.

Получение L-глутамата натрия из акрилонитрила

 

Образующийся рацемат растворим лучше, чем каждый из оптических изомеров в отдельности, поэтому выделение L-формы из насыщенного раствора осуществляют добавкой кристаллов L-глутамата натрия.

 

 

Рис. Путь образования глутамата у Corynebacterium glutamicum (по Nakayama, 1982)

Увеличение проницаемости для глутамата происходит только в одном направлении — из клеток. Но в естественной мелассной среде, в которой культивируют продуценты, может содержаться достаточно высокое количество биотина. В этом случае искусственно увеличивают проницаемость клеточных поверхностных слоев. Для этого в среду во время логарифмической фазы роста вносят пенициллин, или цефалоспорин С, поверхностноактивные вещества (ПАВы), под действием которых из клеток экстрагируются фосфолипиды или нарушается целостность клеточной стенки, в результате чего вытекает глутаминовая кислота.

Большую часть глутаминовой кислоты получают со штаммом С. glutamicum, требующим биотин на углеводных средах. Молекулярный выход глутамата из сахарозы составляет 50%, а концентрация в культуральной жидкости достигает 100 г/л. Во время роста сверхпродуценты аккумулируют глутамат внутриклеточно, пока пул не составит 50 мг/г клеток. По достижении такой концентрации срабатывает ретроингибиторная регуляция, прекращающая дальнейшее накопление аминокислоты, если проницаемость мембранного барьера не изменяется. При возникновении пропускающей мембраны внутриклеточное содержание глутамата быстро падает до 5 мг/г клеток. Для продукции глутамата могут быть использованы ауксотрофы по глицерину или олеату. При дефиците этих веществ в среде тоже образуется пропускающая мембрана. Есть мутанты, экстрагирующие в больших количествах глутаминовую кислоту в присутствии биотина. На ацетатной среде с помощью В.flavum получают до 98 г/л глутамата.

Глутамин. Дикие штаммы С. glutamicum образуют также L-глутамин, L-пролин, L-аланин и L-валин. В слабокислой среде, содержащей избыточное количество ионов Zn и высокую концентрацию NH4C1, усиливается образование L-глутамина.

Для энзиматического пути чаще всего используют микробные ферменты, которые работают вне клетки или в составе неживой микробной клетки. Энзиматический путь дорог, так как требует дорогих исходных субстратов и ферментов; если ферменты нестабильны, себестоимость продукта возрастает. L-аспарагиновую кислоту, L-аланин, L-серин и L-цистеин производят в одноступенчатых энзиматических реакциях с использованием предшественников. .DL-метионин, DL-аланин и глицин — синтетическим химическим путем.

В соответствии с требованиями МРТУ 18/210—68 глутамат натрия пищевой должен иметь следующий состав (в %):

Основное вещество, не менее …….. 94           Влага, не более………1

Хлорид натрия, не более ......................5        Общий азот, не менее .   7,02

 

Заключение

 

Производству аминокислот в после кормового белка, уделяется наибольшее внимание. Это обусловлено прежде всего высокой питательной ценностью получаемых на их основе кормов отдельных продуктов питания. Недостаток в рационе (дефицит) отдельных аминокислот, особенно незаменимых, которые не синтезируются в достаточном количестве и с необходимой скоростью в организме животного или человека, отрицательно называется на росте и развитии, может привести к различного рода заболеваниям. Добавка к рациону животных несколько десятых долей процента дефицитной аминокислоты может повысить кормовую ценность белка более чем в 2  раза.

Производство аминокислот в мире постоянно возрастает и в настоящее время составляет около 400 тыс. т в год. Мировой уровень производства в год для глутаминовой кислоты 200 тыс. т. В меньших масштабах орга-низовано производство лейцина, изолейцина, пролина, треонина (потребность в нем составляет около 130 тыс. т в год) и ряда дpyrux аминокислот, необходимых для получения кормовых препаратов и специальных продуктов питания. Только для нужд сельского хозяйства расходуется практически весь производимый в мире лизин и половина мирового производства метионина.

Среди возможных способов получения аминокислот в промышленном масштабе наибольшее значение имеют микробиологический и химический. В современной мировой практике с помощью микробиологического синтеза получают около 60% всего объема производимых аминокислот. И, видимо, в дальнейшем с ростом мощности предприятий и номенклатуры выпускаемых готовых L-форм препаратов отдельных аминокислот доля микр биологического способа производства будет увеличиваться. Значительный интерес, проявляемый к данному способу получения аминокислот, обусловлен прежде всего его высокими технико-экономическими показателями по сравнению с другими способами, а также возможностью организовать в пределах одного предприятия получение как кормовых препаратов, так и особо чистых индивидуальных аминокислот, пригодных к использованию в пищевой и медицинской промышленности.

К настоящему времени разработаны и реализованы в промышленном масштабе производства многих аминокислот методом органического синтеза. С его помощью производят D,L-метеонин, глутаминовую кислоту, лизин, триптофан, треонин, глицин и   ряд  других.   По  современным  технологиям  осуществляют синтез индивидуальных аминокислот с высоким выходом и высокой  степенью  химической  очистки.  Однако данный  способ имеет ряд существенных недостатков, не позволяющих рекомендовать его для создания многотоннажного производства. Выпуск продуктов кормового и пищевого назначения возможен только на основе биологически активных L-форм аминокислот. В результате химического синтеза всегда образуются рацематы — равновесные смеси L- и D-форм аминокислоты, требующие в дальнейшем достаточно сложной  и (или)   дорогостоящей  очистки. Присутствие D-формы в готовом продукте всегда нежелательно не только потому, что она представляет собой балласт, поскольку не усваивается организмом человека и животного, повышает расходные коэффициенты используемого сырья на 1 т продукции, но у некоторых аминокислот она обладает токсичными свойствами. Исключение составляют глицин и метионин. Для первого не существует оптически активных изомеров. У второго D.L-формы усваиваются организмом человека и животного в равной мере