Вирус ящура

Вирус ящура

 

Ящур  – остропротекающая высококонтагиозная болезнь парнокопытных, проявляющаяся лихорадкой, везикулярным поражением слизистых оболочек рта, кожи венчика и вымени, у молодых животных – поражением миокарда и скелетных мышц. Ящур регистрируется во многих странах мира.

           Актуальность темы.

 

Для России постоянно существует опасность проникновения этой болезни  из сопредельных азиатских государств, свидетельством чего являются вспышки  ящура на территории РФ в 1995, 2000, 2004 и 2005г.г., вызванные заносом инфекции из Китая. В этой ситуации разработка и совершенствование средств  и методов диагностики ящура  напрямую связаны с проблемой  обеспечения зоосанитарной и экономической безопасности страны.

    Возбудитель ящура  - безоболочечный РНК-содержащий вирус семейства Picomaviridae, рода Aphthovirus. Геном вируса кодирует четыре структурных и восемь неструктурных белков. Обе группы белков вызывают выработку антител у животных во время инфекции. Однако у вакцинированных животных обнаруживаются антитела, в основном, к структурным протеинам. Это объясняется тем, что при изготовлении вакцины проводится частичная очистка вируса, в процессе которой большинство неструктурных белков удаляется вместе с клеточным дебрисом.

    Обнаружение антител  к неструктурным белкам вируса  ящура является важным инструментом  контроля за заболеванием. Этот метод позволяет дифференцировать вакцинированных животных от реконвалесцентов и выявлять бессимптомных вирусоносителей среди вакцинированного поголовья. В связи с тем, что Россия проводит политику противоящурной вакцинации скота вдоль своих южных границ, наличие диагностических средств, позволяющих обнаруживать в вакцинированных стадах инфицированных животных, чрезвычайно актуально.

    В настоящее  время на мировом рынке ветеринарных  диагностикумов представлено несколько иностранных коммерческих тест-систем для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура. Они основаны на использовании в качестве антигенов синтетических пептидов или рекомбинантных белков вируса ящура, экспрессированных в E.coli или в бакуловирусной системе. Однако отечественных тест-систем до сих пор создано не было.

 

В естественных условиях к вирусу ящура восприимчивы домашние и дикие парнокопытные. Могут заражаться и бессимптомно переболевать собаки и кошки. Человек  заражается редко при употреблении необеззараженного молока от больных  животных.

РНК-содержащий вирус относится к семейству  Picornaviridae, роду Aphtovirus. Геном представлен единой односпиральной линейной плюс-РНК. Вирионы вируса представляют собой лишенные суперпапсидной оболочки частицы кубической симметрии диаметром 22–30 нм.

Устойчивость  к физико-химическим воздействиям. Вирус ящура устойчив к эфиру, хлороформу, фреону. Быстро инактивируется в среде с рН 6,0 и ниже. Наиболее стабилен при рН 7,0–7,5. Хлорная известь, креолин, крезол, фенол убивают вирус лишь через несколько часов. Растворы щелочей (2%-ные) инактивируют его за 10 мин. Вирус устойчив к влиянию факторов внешней среды; афтозная лимфа, содержащая вирус, инактивируется при температуре 31°С за 24 ч, в молоке при температуре от 66 до 78°С вирус погибает через 1 мин. Низкие температуры его консервируют: при минус 40 – минус 70°С сохраняет биологические свойства несколько лет. В сточных водах вирус выживает до 103 дней. Хороший консервант – 50%-ный раствор глицерина на фосфатном буфере, в нем при 4–8°С вирус сохраняется в течение 40 дней. Лучшие дезинфицирующие средства – 2- или 3%-ные горячие растворы гидрокарбоната натрия и 1%-ный раствор формальдегида.

В вируссодержащей  суспензии присутствуют инфекционные инеинфекционные вирусные частицы: 140S – полные вирионы; 5S – капсиды без РНК; 12S-14S – белковые субъединицы и Via-чтиген, который находится в инфицированных клетках, но не является составной частью вириона. Все названные компоненты обладают антигенными свойствами, но иммуногенными являются лишь 140S- и 755-частицы. Инфекционностью обладают только HOS-частицы (полные вирионы).

Антигенная вариабельность.

В настоящее время известны 7 антигенных типов вируса ящура: А, О, С, Сат-1, Сат-2, Сат-3 и Азия-1. Внутри основных типов существуют варианты, или подтипы, отличающиеся друг от друга. Тип А имеет 32 варианта, тип О – 11 вариантов, тип С –5, тип Сат-1 –7 вариантов, тип Сат-2 – 3 варианта, тип Сат-3 – 4 варианта и тип Азия-1 – 2 варианта. Антигенные типы и варианты, установленные в РСК, различаются и иммунологически. Переболевшие животные приобретают выраженный иммунитет к гомологичному вирусу. Следовательно, для специфической профилактики ящура на каждый тип вируса должна быть вакцина.

В организме естественно восприимчивых животных вирус индуцирует образование вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

Вирус культивируется на естественно восприимчивых и  лабораторных животных: новорожденных  мышатах и крольчатах, хомяках 60-дневного возраста, взрослых морских свинках. Хорошо размножается в культуре клеток почек восприимчивых животных, в  культуре эксплантантов эпителия языка крупного рогатого скота и в некоторых перевиваемых линиях клеток (ВНК-21, СПЭВ и др.) с выраженным цитопатическим действием.

Экспериментальная инфекция. Легко воспроизводится путем аппликации вируссодержащего материала в скарифицированную поверхность слизистой языка, десен крупного рогатого скота, овец и свиней (в пятачок), а также при подкожной инокуляции вируса новорожденным мышатам или крольчатам и внутрикожном введении материала в плантарную поверхность задних лапок морских свинок.

Инкубационный период длится 1–3 дня, иногда до 7–10 дней. Самый характерный признак данного  заболевания у животных – везикулярное поражение слизистых рта, кожи венчика  и вымени. У крупного рогатого скота  и свиней ящур протекает остро, у  взрослых животных, как правило, доброкачественно. Заболевание очень быстро распространяется. Вначале отмечают ухудшение аппетита, повышенную саливацию, повышение температуры  тела (до 40,5-41,5°С). На 2–3-й день на внутренней поверхности губ и на языке  появляются афты. У некоторых животных афты образуются на вымени. Заболевание  конечностей сопровождается хромотой. Через сутки афты разрываются  и образуются эрозии. Через 2–3 нед. эрозии заживают и животные выздоравливают. У свиней, овец и коз поражение наблюдают чаще на конечностях и реже на слизистых оболочках рта. Довольно часто поражается вымя. У молодняка ящур обычно протекает злокачественно (гибель – 80% _и более), афт, как правило, нет.

Патологоанатомические изменения.

При вскрытии павших молодых животных отмечают геморрагическое  воспаление кишечника и дегенеративные изменения в мышцах сердца («тигровое» сердце), подобные изменения находят  в скелетных мышцах.

Локализация вируса. От больных животных вирус можно выявить уже в инкубационный период из молока, спермы, слюны (за 4–7 дней до клинических признаков). Наибольшее количество вируса содержится в эпителии и жидкости везикул (до 10⁸ИД/г). Экскреты и секреты больных животных инфекционны более 10 дней. Выделяется вирус и с выдыхаемым воздухом. Переболевание может сопровождаться длительным вирусоносительством. Около 50% крупного рогатого скота может выделять вирус в течение 8 мес., а некоторые – до двух лет. У свиней персистентного носительства вируса не установлено. В стадах буйволов инфекцию в течение многих лет поддерживают вирусоносители и животные со скрытым течением инфекции.

Источником инфекции служат больные животные и вирусоносители. Весьма существенна эпизоотологическая роль диких парнокопытных. Вирус очень контагиозен, поэтому болезнь быстро распространяется среди восприимчивых животных. В распространении ящура серьезную роль играют продукты и сырье животного происхождения, а также предметы ухода, навоз и корма, загрязненные выделениями больного скота. Переносчиками инфекции могут быть и невосприимчивые к ящуру животные (собаки, кошки, лошади и птицы).

Диагноз на ящур ставят на основании эпизоотологических данных (высокая контагиозность и избирательное поражение только парнокопытных), клинических признаков (везикулярное поражение слизистых оболочек рта, кожи, конечностей и вымени), патологоанатомических изменений (при гибели молодняка – поражение кишечника и мышц сердца) и результатов лабораторных исследований.

Диагностировать ящур по клиническим признакам довольно легко, но для врача хозяйства  важно знать, каким типом вируса ^{ВЫЗВАНО} заболевание, чтобы применять соответствующую вакцину. Тип вируса определяют в лаборатории.

Взятие и подготовка материала. Для лабораторных исследований от 2–3 больных животных отбирают не менее 5 г стенки и содержимого афт на слизистой оболочке языка (у крупного рогатого скота), на пятачке (у свиней), на коже венчика и межпальцевой щели (у крупного и мелкого рогатого скота, свиней, верблюдов и др.). При отсутствии афт берут кровь животных в момент температурной реакции, из трупов молодняка животных всех видов – лимфатические узлы головы и заглоточного кольца поджелудочную железу и мышцу сердца. Для исследования на вирусоносительство берут пищеводно-глоточную слизь (специальным зондом).

Материал необходимо получать так, чтобы предупредить вынос вируса за пределы неблагополучного очага  и лаборатории, обезопасить персонал, работающий с инфекционным материалом.

Для этого:

а) ветврач  хозяйства должен иметь определенные навыки взятия материала от больных  животных;

б) необходимо подготовить все для отбора материала  – пинцеты, ножницы, салфетки, толстостенные  флаконы, лейкопластырь, резиновые  пробки, 50%-ный раствор стерильного  глицерина на изотоническом растворе хлорида натрия, термос с охлаждающей смесью, дезраствор – 2%-ный раствор NaOH или 1%-ный раствор уксусной или молочной кислоты; спецодежду – халаты, комбинезоны, косынки или шапочки, маски, резиновые сапоги, перчатки и т.д. Все необходимое помещают в контейнер и едут в неблагополучный очаг, где, прежде чем войти в помещение с больными животными, переодеваются; в) после взятия материала от больных животных инструменты, маску, перчатки погружают в дезраствор; наружную поверхность флаконов и термоса обрабатывают дезраствором. В санпропускнике снимают всю одежду и принимают душ.

В носовой  полости у людей вирус ящура  переживает до 7 дней, следовательно, в  течение этого времени после  посещения неблагополучного хозяйства  нежелателен контакт со здоровыми  парнокопытными животными.

Пробы материала  без признаков разложения помещают во флаконы с завинчивающимися или  притертыми пробками и замораживают, а при отсутствии условий замораживания  – заливают консервирующей жидкостью (50%-ным стерильным раствором глицерина  на изотоническом растворе NaCI). На флаконы наклеивают этикетки с указанием вида животных, наименования материала, его количества, даты отбора и адреса отправителя. Флаконы ставят в непроницаемый металлический контейнер, опечатывают и помещают в термос со льдом, который тоже опечатывают. К материалу прилагают подписанное врачом сопроводительное письмо, в котором указывают: дату взятия материала, от животных какого вида и какой материал взят, сообщают эпизоотическую обстановку по ящуру в хозяйстве, имя врача. Материал отправляют с нарочным. Для работы с вирусом ящура в лаборатории выделяют отдельную комнату (бокс с предбоксником), где должно быть необходимое оборудование и материалы для проведения диагностической работы (подготовка материала, постановка РСК, биопробы _и т.д.). При работе в боксе полностью сменяют спецодежду и обувь, надевают резиновые перчатки и маску. После работы ничего не обезвреженного выносить из бокса нельзя. Посуду и инструменты кипятят, спецодежду погружают в контейнер для автоклавирования; столы, пол, стены обрабатывают дезинфицирующим раствором с последующим облучением УФ-лучами.

В лаборатории  ведут строгий учет поступившего материала и его расход с точностью  до 1 мг. Поступивший в лабораторию  материал хранят до исследования и  в период использования в закрытом на ключ и опечатанном холодильнике. По окончании работы составляют акт  на уничтожение оставшегося от исследования материала и животных после биопробы.

 

 

Лабораторные  исследования на ящур включают:

– обнаружение  и идентификацию антигена вируса ящура в РСК (определение его  типовой и вариантной принадлежности);

– обнаружение  и титрование антител к вирусу ящура у переболевших животных (реконвалесцентов) в реакции радиальной иммунодиффузии (РРИД) и непрямой реакции иммунофлуоресценции (НРИФ).

Обнаружение и идентификация антигена вируса ящура с помощью РСК. Компоненты реакции: испытуемые антигены из эпизоотических штаммов вируса от заболевших животных; сыворотки морских свинок, гипериммунизированных стандартными типовыми и вариантными штаммами вируса ящура (биофабричного производства); антигены контрольные – из типовых и вариантных штаммов вируса ящура (биофабричного производства); комплемент – свежая или сухая нормальная сыворотка морских свинок; гемолизин биофабричного производства; эритроциты барана – в виде 2%-ной взвеси на физиологическом растворе; 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия на дистиллированной воде; набор специфических сывороток и антигенов к другим вирусам, вызывающим везикулярные поражения.

РСК ставят в различных объемах: в общем объеме 1 мл – берут 0,2 мл каждого компонента, в общем  объеме 0,5 мл – берут 0,1 мл каждого  компонента или микрометодом – общий объем 0,125 мл, при этом каждый компонент равен 0,025 мл.

Приготовление антигена вируса ящура.

Стенки  афт от больных животных отмывают от консервирующей жидкости физиологическим  раствором рН 7,4–7,6, высушивают фильтровальной бумагой, взвешивают, измельчают и тщательно растирают в фарфоровой ступке со стерильным битым нейтральным стеклом до получения однородной массы, к которой добавляют двойное по отношению к массе афт количество физиологического раствора, т.е. на 1 г афт –2 мл раствора. Полученную 33% суспензию экстрагируют при комнатной температуре 2 ч, при минус 10–20С в течение 5–18 ч. После размораживания центрифугируют 15–30 мин при 3000–5000 мин^-1. Надосадочную жидкость инактивируют при 58°С 40 мин. После инактивации, если в жидкости остаются хлопья, ее центрифугируй повторно 10–15 мин при 3000 мин^-1 и затем используют в качестве антигена в РСК.

Этапы постановки РСК.