Вирус ящура

1. Титрование гемолизина. Проводят при получении новой серии по общепринятой методике. В главный опыт берут гемолизин в 4-кратной концентрации от его предельного титра (рабочее разведение).
2. Приготовление гемолитической системы (гемсистемы). Для этого смешивают гемолизин в рабочем разведении с равным количеством 2%-ной взвеси эритроцитов барана.
3. Титрование комплемента. Проводят в гемолитической системе в день постановки главного опыта по общепринятой методике. Для главного опыта РСК комплемент берут с излишком в 1% от его титра в гемсистеме. Правильно взятая рабочая доза комплемента – непременное условие нормального течения реакции, что обеспечивает достоверность результатов.
4. Приготовление рабочего разведения типоспецифических сывороток. В главный опыт для определения типа вируса ящура сыворотки используют в удвоенном титре (от предельного титра), например, если предельный титр сыворотки составляет 1:40, то рабочий титр будет 1: 20.
5. Приготовление рабочего разведения типоспецифических антигенов. Антигены также используют в удвоенных титрах, например, если предельный титр равен 1: 6, то рабочий титр будет 1: 3.
6. Испытуемый антиген в реакции исследуют цельным (33%-ная взвесь) и в разведениях 1:2, 1:4 и 1:8.

Примечание. По представленным результатам все  стандартные антигены и сыворотки  активны и типоспецифичны. Испытуемый антиген относится к типу А.

Учет  реакции ведут через 5–10 мин после водяной бани, и окончательный результат получают через 10 – 12 ч. Степень задержки гемолиза оценивают в крестах: (++++) – 100%-ная задержка гемолиза; (+++) – 75%-ная; (++) – 50%-ная; (+) – 25%-ная задержка гемолиза; (–) – полный гемолиз.

Если испытуемый антиген гомологичен специфическим антителам, то будет задержка гемолиза и реакция будет положительной; если же гомологичные антитела отсутствуют, реакция отрицательная и наблюдается полный гемолиз.

При производственной необходимости после определения  типовой принадлежности вируса ящура  устанавливают его подтип (вариант). Для этого ставят РСК по той  же методике, но используют вариантные сыворотки и вариантные антигены установленного типа. Причем вариантные сыворотки используют в предельном титре, а антигены в удвоенном. Антиген (исследуемый) относят к тому варианту, с сывороткой которого он дает положительную реакцию в более высоких разведениях.

Когда доставленного  из хозяйства вирусного материала  недостаточно для исследования в  РСК, проводят его расплодку на культуре клеток или на 3–6-дневных мышатах-сосунах, или на взрослых морских свинках. Мышатам исследуемую суспензию вводят подкожно в области спины в дозе 0,1–0,2 мл, морским свинкам – внутрикожно в подушечки обеих задних конечностей в дозе 0,2–0,5 мл. За животными наблюдают 5–7 дней.

В случае гибели мышат из их тушек готовят  антиген для РСК. У морских  свинок в положительных случаях  на лапках образуются афты; стенки афт  и их содержимое используют в РСК. При необходимости проводят 2–3 «слепых» пассажа. Пробу исследуемого материала  считают отрицательной, если в третьем  пассаже не будет отмечено дегенерации  клеток и падежа белых мышей, а  при исследовании полученных из них  суспензий в РСК не будет обнаружен  антиген вируса ящура.

Ретроспективная диагностика.

Материалом для исследования на наличие антител к вирусу ящура  служат сыворотки крови животных, подозреваемых в переболевании ящуром или другими везикулярными болезнями. Сыворотки крови должны быть взяты не ранее чем через 7 дней с момента появления у животных признаков везикулярного заболевания. На исследование следует направлять 5–10 проб сыворотки от животных каждой возрастной группы. При сомнительных результатах первичного исследования необходимо отобрать кровь повторно от тех же животных через 7 – 10 дней.

Сыворотку, полученную общепринятым методом, консервируют антибиотиками (по 500 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина) или замораживают при минус 20°С. На исследование направляют от каждого животного не менее 5 мл сыворотки в термосе со льдом.

В лаборатории  сыворотку исследуют с помощью  реакции радиальной иммунодиффузии (РРИД) и реакции непрямой иммунофлуоресценции (НРИФ).

РРИД. Сущность реакции заключается в формировании зоны специфической преципитации вирусных антигенов антителами, включенными в состав агарового геля. РРИД типоспецифична.

Для постановки реакции расплавленный 2%-ный агар смешивают с равным объемом нагретой до 50–55°С испытуемой сыворотки в разведениях 1:5,1:10,1:20 и т.д. до 1: 320 и наносят по 4 мл на предметное стекло. В застывшем агаре вырезают лунки (диаметром 4–7,7 мм), которые заполняют эталонными типовыми антигенами. Затем стекла помещают во влажную камеру при температуре 37°С. Результаты учитывают через 6–7 ч и окончательно через 18 ч.

Положительная реакция характеризуется образованием кольца преципитации в виде опалесцирующей зоны вокруг лунки с антигеном, гомологичным возбудителю, вызвавшему заболевание.

Антитела, обнаруженные в испытуемой пробе  сыворотки, относят к тому серотипу, с антигеном которого они дали положительную реакцию. Их титром считают  максимальное разведение испытуемой сыворотки, с которым наблюдается положительная  реакция.

После переболевания животных титры антител обычно превышают 1: 160.

НРИФ. Данная реакция основана на том, что наличие антител в сыворотке крови переболевших животных выявляет специфическое свечение (комплекса антиген + антитело), а при использовании сывороток от вакцинированных животных свечение комплекса не наблюдается.

Техника постановки заключается в следующем. На препарат из культуры клеток ВНК-21, ПЭК, ПЭС, инфицированных вирусом ящура любого типа, наносят испытуемую сыворотку в разведении 1:10 и 1:20; инкубируют во влажной камере при 37°С 30 мин; отмывают несвязавшиеся антитела; подсушивают на воздухе и окрашивают смесью рабочих разведений флуоресцирующей антивидовой сыворотки и бычьего альбумина, меченного родамином; Инкубируют во влажной камере при 37°С 30 мин; отмывают; подсушивают и просматривают под люминесцентным микроскопом (объектив х40, окуляр х4 или х5). Положительная реакция характеризуется зеленым или из рудно-зеленым свечением цитоплазмы клеток.

Диагностический результат считают положительным  при обнаружении специфического свечения хотя бы в одной из 5–10 сывороток, присланных из данного хозяйства.

Для определения  уровня обнаруженных таким образом  антител в испытуемой сыворотке  проводят ее титрование. Для этого  испытуемую сыворотку разводят от 1: 40 до 1: 1280, и каждым разведением обрабатывают заведомо инфицированный препарат, как  было указано выше. О титре постинфекционных антител в сыворотке судят по предельному ее разведению, которое способно давать положительную НРИФ. Наличие специфического свечения в препаратах, обработанных испытуемой сывороткой в разведениях 1:10, 1:20 и 1:40, свидетельствует о том, что сыворотка была получена в период острого переболевания животного ящуром, т.е. с момента его заболевания прошло около 7 дней, а наличие специфического свечения в разведениях 1: 80 и выше – о том, что сыворотка взята от животного-реконвалесцента.

Результаты  исследования на ящур оформляют в  виде протокола, в котором указывают  дату исследования, наименование хозяйства, материала, краткие эпизоотологические данные и т.д. и обязательно наименование компонентов, используемых в исследовании, характеристику контролей.

Необходимо  отметить, что для индикации и  типирования вируса ящура разработано много других методов, таких, как ПЦР, РНГА, ИФА, метод перекрестного иммунитета и др.; для обнаружения и типирования антител – РН, РНГА, реакция серозащиты на мышатах-сосунах и др.

Дифференциальная диагностика. Необходимо исключить другие заболевания животных с везикулярным синдромом, такие, как ВД, ИРТ, везикулярный стоматит, у свиней – везикулярную болезнь, везикулярную экзантему, у овец – катаральную лихорадку.

Иммунитет и специфическая профилактика.

Продолжительность иммунитета у животных, переболевших ящуром, составляет 8–12 мес., у свиней – 10–12, у овец – 18 мес. При очень напряженном иммунитете может наблюдаться некоторая устойчивость к заражению гетерологичным типом вируса. При ящуре возникает тканевой и гуморальный иммунитеты. Основное значение в защите животных от заболевания принадлежит гуморальным факторам иммунитета. Для специфической профилактики ящура применяют инактивированные вакцины. В нашей стране нашли широкое применение следующие 3 вакцины: лапинизированная гидроокисьалюминиевая сапонинформолвакцина, которую готовят из вируса, репродуцированного в организме новорожденных крольчат; гидроокисьалюминиевая сапонинформолвакцина из вируса, культивируемого в ткани слизистой оболочки языка.

Для свиней используют противоящурную эмульгированную вакцину из лапинизированного вируса.

Иммунитет после вакцинации у взрослых животных длится 4– 6 мес. После ревакцинации иммунитет более напряженный и продолжительный.

Молодняк, родившийся от иммунных животных, получает пассивно антитела с молозивом. Антитела у телят сохраняются в течение 5 мес., хотя пассивная защита продолжается до 3–4 мес.

Инактивированные  вакцины могут быть моно- или поливалентными, т.е. содержать антигены одного или  многих типов и вариантов вируса. Живые вакцины против ящура не разработаны. Проводятся исследования по разработке и использованию синтетических  вакцин, а также молекулярных вакцин, полученных с помощью методов  генной инженерии.

 

 

 

 

Культивирование вирусов в культуре клеток

 

Культуры  клеток и тканей – это кусочки  органов и тканей, выращенных в  питательной среде вне организма, сохраняют жизнеспособность, а некоторые  размножаются.

Для культивирования необходимы:

– исходный материал (ткани эмбрионов, клетки почки, кожи, селезенки). Обязательно соблюдение правил асептики и антисептики;

– температура должна быть 36 -38 градусов Цельсия;

– питательная среда, которая должна обладать буферностью и изотоничностью, т.е. включать в себя Na, K, Ca, Mg, Cl, фосфаты, карбонаты;

– РН среды должна быть 7,2 – 7,4 единиц;

– все питательные элементы, особенно глюкоза, которая отвечает за энергетический обмен;

– аминокислоты;

– витамины, которые являются ко-ферментами.

Среды бывают двух видов:

1. натуральные или естественные (кровь, амниотическая жидкость);
2. синтетические и полусинтетические (из химических веществ, солевые растворы – раствор Эрла и раствор Хэнкса)

Методика сводится к следующему:

1. подбору  культуры клеток;

2. получению  вирус – содержащего материала;

3. подготовке  для заражения;

4. заражению  клеток вируссодержащим материалом;

5. культивированию  вируса в клетках;

6. индикации  вируса в культуре клеток;

7. сбору  культуральной жидкости и идентификации в ней вируса.

Подбор культур клеток. Не всякая клетка чувствительна к любому вирусу. Вирус к первичной культуре обычно успешно адаптируется при условии, если культура получена из органов животного, естественно восприимчивого к данному вирусу. Однако адаптация вируса к перевиваемым клеткам более сложна, а в ряде случаев неосуществима. Для культивирования некоторых вирусов до сих пор неизвестно ни одной клеточной системы. Для культивирования вируса используют обычно молодые клетки, т.е. в первый день формирования монослоя, а в некоторых случаях (для парвовирусов свиней) клетки заражают при их посеве, так как вирус интенсивно размножается при наличии делящихся клеток (когда они находятся в стадии логарифмического роста).

Заражение клеток.

Для этого  отбирают пробирки (или матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сливают, клетки 1–2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные антитела и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1–0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распределяют его равномерно по слою клеток. В таком виде пробирки (матрасы) оставляют от 1 до 2 ч при 22 или 37С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Затем вируссодержащий материал удаляют из пробирок (матрасов) и наливают поддерживающую среду (в пробирку 1–2 мл, в матрасы около 10% его объема). При выделении вируса из патологического материала некоторые пробы (фекалий и др.) могут оказывать токсическое действие на клетки, поэтому после адсорбции вируса монослой клеток отмывают 1–2 раза раствором Хенкса (или питательной средой) и затем наливают поддерживающую среду.

Культивирование вируса.

Пробирки (матрасы) закрывают герметически резиновыми пробками и ставят на инкубацию в  термостат при 37°С. Наиболее широко применяют стационарное инкубирование. При этом матрасы кладут в горизонтальном положении, пробирки – под углом 5° так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). В ряде лабораторий зараженные культуры клеток инкубируют на вращающейся системе – роллерах. Используя этот метод, удается получать большой выход вируса, имеющего более высокий инфекционный титр, чем при стационарном культивировании.

Для каждой пробы материала обычно используют не менее 4–10 пробирок с культурой  клеток. Для контроля оставляют 4–6 пробирок с незараженной культурой  клеток, в которых заменяют ростовую среду на поддерживающую.

В культурах клеток, зараженных вирусом, питательную среду можно не менять в течение 7 дней, а рН среды (6,9–7,4) поддерживать с помощью 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия. При более длительном культивировании инфицированных клеток (аденовирусы и др.) среду меняют.

Все пробирки (матрасы) после заражения клеток ежедневно исследуют под малым  увеличением микроскопа, сравнивая  культуры клеток, зараженные вирусом, с контрольными.

В термостате адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают  внутрь их и начинается их репродукция. Новые вирусные частицы покидают (полностью или частично) клетки, в которых они образовались, проникают в непораженные клетки, репродуцируются в них, переходят в новые клетки и поражают их. Так продолжается до тех пор, пока есть живые неповрежденные клетки. В результате этого процесса практически все клетки в матрасе или пробирке поражаются вирусом, хотя абсолютно все почти никогда не поражаются.