Генетически модифицированные организмы. Принципы получения, применение

1.2.2. Получение трансгенных растений

Вся работа с трансгенными растениями направлена на коренное изменение методов традиционной селекции – желаемые признаки получаются благодаря введению нужных генов непосредственно в растение вместо длительной работы по скрещиванию различных линий. Сложность такого подхода заключена в том, что в отличие от бактерий и дрожжей, растения являются многоклеточными организмами. Для получения продукта нужный ген должен находиться в каждой клетке организма, что достаточно сложно осуществить. Но у растений возможна полная регенерация in vitro из недифференцированных соматических тканей с получением нормальных, способных давать семена, растений. Это свойство, называемое тотипотентностью, дает уникальную возможность получить из единичных клеток, генотип которых можно изменить аналогично микроорганизмам, целое растение с новыми признаками. Задача осталась за поиском подходящего вектора для переноса нужного гена в выделенные камбиальные клетки. [3]

Исследователям помогла сама природа. Еще древним грекам было известно явление, называемое корончатыми галлами. В пораженных растениях клетки корончатых галлов приобретают способность неограниченно размножаться, оставаясь недифференцированными. Такие клетки по своим свойствам очень похожи на раковые клетки животных. Но только в XX веке ученым удалось установить и изучить причину возникновения такого явления. Виновницей оказалась одна из почвенных бактерий –Agrobacterium tumefaciens. Такая бактерия, как и многие другие, содержит плазмиды. Одна из них, названная Ti-плазмида (от английского сокращения «опухоль индуцирующая»), и оказалась опухолеродным агентом для клеток зараженного растения.

Ti-плазмида состоит из нескольких  функционально различных участков  ДНК. Наиболее важную роль играет  участок Т-ДНК, который переносится  в клетку зараженного растения  и встраивается в ее хромосому. Там находятся гены синтеза фитогормонов и опинов. Фитогормоны ауксин и цитикинин подавляют дифференцировку опухолевых растительных клеток и переводят их в состояние деления, а опины используются бактерией как источник углерода, азота и энергии. Другими участками ДНК в Ti-плазмиде являются tra-область, где локализованы гены, контролирующие конъюгацию бактерий, и ori-область, продукты которой обеспечивают размножение плазмиды в бактериальной клетке. Еще один важный локус ДНК называется vir-область. Там содержатся гены, ответственные за перенос Т-ДНК в растительную клетку и встраивание ее в хромосому. [Приложение 2, рис.1] [5]

Чаще всего для создания трансгенных растений используют следующий подход. Сегмент Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в стандартную плазмиду-вектор бактерии Escherichia coli. Рекомбинантная плазмида размножается, и в участок Т-ДНК вставляют нужный ген так же, как и в обычную плазмиду, с использованием рестриктаз. Такой молекулярный гибрид вводят в Agrobacterium tumefaciens, содержащий неизмененную Ti-плазмиду. Благодаря процессу рекомбинации происходит обмен гомологичными участками ДНК рекомбинантной и Ti-плазмид. В результате получится рекомбинантная Ti-плазмида, несущая нужный ген. Делают небольшое повреждение в растительной ткани, выделяется сок с кислой реакцией и высокой концентрацией лигнина. Это специфически стимулирует экспрессию генов vir-области. Лигнин взаимодействует с продуктом гена virA, передается сигнал внутрь клетки, активируется продукт гена virG, что в свою очередь активирует остальные гены вирулентности. Белок VirD2 в комплексе с белками VirC1 и VirD1 вносит одноцепочечные разрывы в нуклеотидные последовательности правой и левой границ Т-ДНК. Синтезируется новая цепь Т-ДНК, а старая, с присоединенным к 5’-концу VirD2, вытесняется. Процесс повторяется, и в клетке накапливается одноцепочечная Т-ДНК, готовая к переносу. Затем комплекс Т-ДНК с белками VirD2 и VirE2 направленно переносится в клетку растения с помощью процесса, сходного с бактериальной конъюгацией. Перенос происходит через пили, а затем через канал в клеточной мембране растения, сформированный белком VirE2. VirD2 и VirE2 способствуют проникновению Т-ДНК в геном растения. [Приложение 2, рис.2] Сайты инсерции случайны. Процесс длится около 30 минут. Единичные растительные клетки заражаются, выращивается целое растение, все клетки которого будут экспрессировать нужный ген. [Приложение 3, рис.1] [5]

Иногда оказывается проще использовать сразу две рекомбинантные плазмиды. Одна из них содержит только vir-область и является плазмидой-помощницей. Вторая плазмида должна содержать Т-ДНК со встроенным нужным геном. Плазмида-помощница способна переносить в растительную хромосому не только свою Т-ДНК, которой у нее и нет, но и соседнюю. Для облегчения отбора полученных ГМ-растений, рекомбинантная Ti-плазмида несет специальный маркерный ген. В отличие от микроорганизмов, где в качестве маркера используется устойчивость к антибиотикам, в растениях используют особые белки, обладающие способностью светиться в ультрафиолетовом свете. Наиболее часто используют гены люциферазы светлячков и ген GFP медузы (по-английски, «зеленый светящийся белок»). [5]

Помимо технологии, основанной на использовании Ti-плазмиды, в последнее время применяются и другие способы переноса рекомбинантной ДНК в растения. Современный арсенал методов трансформации очень обширен и включает такие подходы, как электропорация клеток (пропускание электрического разряда через смесь опытных клеток и рекомбинантных плазмид, при этом в мембранах клеток возникают бреши, и ДНК проникает в клетку и встраивается в геном), встряхивание смеси клеток, ДНК и микроигл (которые прокалывают мембраны аналогично электрическом току),опосредованная вирусами инфекция, микроинъекции ДНК в клетки. Промышленное применение нашла следующая технология: с помощью специального прибора «Shotgan» осуществляется обстрел растительных тканей мельчайшими пульками из золота или вольфрама, одетыми в молекулы ДНК.[4]

В отдельных случаях оказывается необходимо не ввести какой-нибудь новый ген в растение, а наоборот, заблокировать или ослабить действие природного гена. Например, в плоды томата, содержащего белок PG, придающего плодам рыхлость, вводят вектор, содержащий перевернутую копию его гена. В результате транскрипции получается антисмысловая мРНК, которая комплиментарно связывается с нормальной мРНК. Образуется молекула двухцепочечной РНК, которая уже не может служить матрицей для синтеза белка. В результате получаются твердые томаты, они дольше хранятся и более устойчивы к грибковым заболеваниям. Не менее перспективным является направление по генной инженерии генома пластид и митохондрий. В трансгенном материале значительно увеличивается содержание продукта за счет более активных метаболических процессов. Еще множество различных подходов, включая регуляцию активности генов, находятся на стадии разработки. [3]

1.2.3. Получение трансгенных животных

Трансгенные животные - экспериментально полученные животные, содержащие во всех клетках своего организма дополнительную интегрированную с хромосомами и экспрессирующуюся чужеродную ДНК, которая передаётся по наследству. Получение трансгенных животных осуществляется с помощью переноса клонированных генов в ядра зигот или эмбриональных стволовых клеток. Затем в репродуктивные органы реципиентной самки пересаживают модифицированные зиготы или яйцеклетки, у которых собственное ядро заменено на модифицированное ядро эмбриональных стволовых клеток, либо бластоцисты, содержащие чужеродную ДНК эмбриональных стволовых клеток. Имеются отдельные сообщения об использовании спермиев для создания трансгенных животных, однако этот приём пока не получил широкого распространения. [4]

В настоящее время для создания трансгенных животных, кроме микроинъекций, используются другие экспериментальные приемы: инфицирование клеток рекомбинантными вирусами, электропорация, «обстрел» клеток металлическими частицами с нанесёнными на их поверхности рекомбинантными ДНК. Все имеющиеся методы переноса генов пока ещё не очень эффективны. Для получения одного трансгенного животного в среднем необходимы микроинъекции ДНК в 40 зигот мышей, 90 зигот козы, 100 зигот свиньи, 110 зигот овцы и в 1600 зигот коровы. Механизмы интеграции экзогенной ДНК или формирования автономных репликонов при трансгенезе не известны. Встраивание трансгенов у каждого вновь получаемого трансгенного животного происходит в случайные участки хромосом, причём может происходить встраивание как единичной копии трансгена, так и множества копий, располагающихся тандемно в единичном локусе одной из хромосом. Гомология между сайтом интеграции трансгена и самим трансгеном отсутствует. [4]

Глава 2. Положительные аспекты в использовании

2.1. Аргументы сторонников

Самым весомым аргументом сторонников распространения ГМО является рост численности населения Земли и увеличение потребности в продовольствии. Согласно прогнозу Отдела ООН по вопросам народонаселения «Перспективы мирового народонаселения», к 2050 году население Земли приблизится к 10 млрд человек. Вследствие этого к 2050 году, согласно прогнозу Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций, для того, чтобы прокормить население планеты, необходимо увеличить производство продовольствия в мире на 70%. 12 октября 2009 года в Риме на заседании ООН было указано, что увеличение производства продовольствия потребует резкого роста инвестиций в развитие сельского хозяйства, которые должны быть направлены на исследование, разработку и внедрение новых технологий, а также методов ведения фермерского хозяйства и получения новых сортов сельскохозяйственных культур. Спрос на зерно составит около 3 млрд тонн в 2050 году. Годовое производство зерна должно вырасти почти на миллиард тонн (для сравнения: сегодня производится 2.1 млрд т зерна), а производство мяса вырастет на 200 млн т и достигнет 470 млн т в 2050 году. В зависимости от цен на энергоносители производство биотоплива также может способствовать увеличению спроса на сельскохозяйственную продукцию. Эксперты считают, что в мире есть достаточное количество земельных ресурсов, чтобы прокормить будущее население мира.[1]

Сторонники широкого использования ГМО заявляют, что все возможности увеличить продовольственный потенциал в мире фактически исчерпаны, поэтому возникает необходимость искать принципиально новые подходы и широко использовать современные биотехнологии для пополнения запасов продовольствия.

Кроме этого некоторые ученые приводят другие аргументы в пользу ГМО:

• современная биотехнология позволяет использовать нужные гены живых организмов, а также конструировать новые гены, клонировать их и вводить различными методами в организм растения-реципиента. Таким образом, можно создавать новые трансгенные растения с заданными полезными свойствами во много раз быстрее, чем это происходит при традиционной селекции; 

• путем генетических манипуляций можно обеспечить устойчивость сельскохозяйственных растений к болезням, вредителям, пестицидам, сложных климатических условий, они лучше хранятся, можно улучшить их агротехнические свойства, увеличить урожайность, а также замедлить старение и повысить пищевую ценность культур;

• современная биотехнология позволяет при создании новых растений действовать более целенаправленно, чем при традиционной гибридизации. Если первое поколение генетически модифицированных растений включало лишь дополнительные гены устойчивости, то уже следующее поколение приобретает новые свойства, которые ранее определенным растениям не были свойственны. [3]

Американские ученые Б. Глик и Дж. Пастернак выделяют три основные аргументы в пользу распространения ГМ-растений: 

• введение гена (генов) способствует повышению сельскохозяйственной ценности и декоративных качеств культурных растений;

• ГМ-растения могут служить живыми биореактором при малозатратном производстве важных белков;

• генетическая трансформация растений позволяет изучать действие генов в ходе развития растения и других биологических процессов. 

На современном этапе развития генной инженерии ставится задача "научить" растение производить совершенно новые вещества, необходимые как для медицины, так и для других сфер, - особые кислоты, белки с высоким содержанием аминокислот, модифицированные полисахариды, вакцины, антитела, интерфероны, новые полимеры, что не засоряют окружающую среду и прочее.  По мнению ученых биотехнологии открыли перспективы дальнейшего прогресса сельского хозяйства и обеспечения населения Земли необходимым количеством продовольствия. 

Среди преимуществ ГМ культур для сельскохозяйственных производителей выделяют:

• значительное уменьшение использования пестицидов для обработки растений, что уменьшает их вредное воздействие на окружающую среду и здоровье фермеров. С 1996 года в мире использование пестицидов на площадях, где выращиваются ГМ культуры, уменьшилось на 0,286 млн т, по подсчетам ученых снизило их отрицательное воздействие на окружающую среду на 15%;
• уменьшение количества необходимой для обработки земли техники.[1]

В отчете ВОЗ сделала вывод, что генетически модифицированные продукты могут способствовать улучшению здоровья людей и развития человечества, а выгоды ГМО очевидны – рост урожайности, улучшения качества и разнообразия пищевых продуктов, что способствует повышению жизненного уровня. Но при этом подчеркивается необходимость долгосрочных исследований, так как некоторые гены, которые использовались при создании ГМО, ранее отсутствовали в сельскохозяйственных растениях, и следует оценивать их потенциальное влияние на здоровье человека, что позволяет своевременно выявить любые возможные негативные проявления в будущем. Эти замечания очень справедливы. Ген – это не автономная единица. Свойства и информационную составляющую гена определяет его окружения в геноме и среда, в которой он находится. Нельзя понятие «организм» свести к понятию «набор генов», поскольку гены не являются устойчивыми единицами информации, которые могут быть перенесены для генной экспрессии без привязки к контексту. Доказано, что молекула ДНК может быть стабильной в пробирке в лабораторных условиях, но оказаться очень нестабильной в живых организмах, взаимодействуя со своим окружением нелинейно. В этом причина полной непредсказуемости последствий переноса гена от одного вида к другому и именно в этом наибольшая опасность. [3]

2.2. Использование  генетически модифицированных микроорганизмов

2.2.1. Трансгенные  микроорганизмы в медицине

В настоящее время в мире, по данным ВОЗ, насчитывается около 150 млн людей, страдающих диабетом. Приблизительно 20 млн пациентов нуждаются в инсулиновой терапии. Животный инсулин, получаемый от свиней и телят, весьма дорогостоящий, кроме того, он немного отличается по молекулярному составу от человеческого. Поэтому разработка технологии производства искусственного инсулина является поистине триумфом генетики. Ученым удалось методом проб и ошибок осуществить в клетках E.coli биосинтез молекул проинсулина, которая соответствующим образом преобразуется (формируются дисульфидные связи между цепями), превращаясь в молекулу инсулина. Далее была выделена иРНК проинсулина. Используя ее в качестве матрицы, с помощью обратной транскиптазы синтезировали комплементарную ей молекулу ДНК, которая представляла собой практически точную копию натурального гена инсулина. После пришивания к гену регуляторных элементов и переноса конструкции в генетический материал E.coli стало возможным производить инсулин на микробиологической фабрике в неограниченных количествах. Кроме того таким же способом стали получать гормон роста человека - соматотропин.

Ученые Корнельского университета (Итака, штат Нью-Йорк), работающие под руководством Джона Марча, вывели на новый уровень использование пробиотиков – полезных микроорганизмов, на протяжении столетий употребляемых людьми в составе молочных продуктов. Они «запрограммировали» непатогенный штамм кишечной палочки на синтез белка GLP-1 – глюкагоноподобного пептида. В организме здорового человека этот белок синтезируется клетками кишечника и, среди прочих эффектов, запускает продукцию инсулина в поджелудочной железе. Авторы продемонстрировали, что в лабораторных условиях в присутствии глюкозы секретирующие GLP-1 бактерии запускают синтез инсулина в культуре клеток кишечника человека. Механизмы, лежащие в основе этого феномена, пока не ясны. Введение новых бактерий в диету мышей с искусственно вызванным диабетом за 80 дней снизило уровень глюкозы в крови животных до нормального, в то время как у животных контрольной группы, не употреблявших бактерий, этот показатель оставался повышенным. Бактерии синтезируют определенное количество белка, соответствующее ситуации в организме хозяина, что минимизирует необходимость самостоятельного мониторинга состояния организма. Более того, пробиотики стоят совсем дешево, кроме того, при желании их можно размножать в составе закваски для йогурта. [12]