Глутатион-зависимые процессы в развитии лекарственной устойчивости опухолевых клеток

В плазме крови определяли содержание продуктов ПОЛ – диеновых конъюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА), в эритроцитах: ВГ и глутатионзависимых ферментов – глутатионпероксидазы (ГП), глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионредуктазы(ГР). Проверку статистических гипотез о различии между исследуемыми группами проводили с использованием непараметрических критериев Ван дер Вардена и Вилкоксона – Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение. Активация ПОЛ у больных острыми воспалительными заболеваниями сопровождалась повышением концентрации токсичных продуктов перекисного каскада в плазме крови в острый период и в период клинического выздоровления. В зависимости от степени выраженности острого воспаления в червеобразном отростке на пике заболевания концентрация МДА у пациентов с гангренозным аппендицитом была увеличена в 3,2 раза, с флегмонозным – в 2,6 раза, с катаральным – в 2,2 раза относительно значений аналогичных показателей у здоровых доноров. Содержание ДК в плазме у этих же пациентов повышалось в 1,8–2,0 раза относительно значений у здоровых лиц. У пациентов с флегмонами и абсцессами мягких тканей конечностей содержание продуктов ПОЛ, повышенное в острый период болезни относительно контрольных величин (МДА – в 2,9 раза, ДК – в 1,9 раза), при исчезновении клинических симптомов достоверно не менялось.  
Комплекс ГП, ГТ и ГР в условиях окислительного стресса является наиболее мощной линией АОЗ. Глутатионзависимые ферменты ограничивают процессы ПОЛ и оказывают мембраностабилизирующий эффект путем детоксикации Н2О2 и восстановления нестабильных органических гидропероксидов клеточных мембран. У всех пациентов в острую фазу заболевания антиоксидантные эффекты компонентов глутатион-зависимой системы (ВГ, ГП, ГР, ГТ) в эритроцитах снижались, способствуя усугублению проявлений окислительного стресса. Так, по сравнению с контрольными значениями, активность ГП уменьшалась в 3,1, 1,5 и 1,9 раза, согласно степени выраженности воспаления в червеобразном отростке (соответственно, гангренозное, флегмонозное и катаральное) и в 1,9 раза в группе пациентов с флегмонами и абсцессами мягких тканей конечностей. При выписке из стационара у больных активность ГП повышалась, но во всех группах значения показателя оставались ниже контроля, кроме пациентов с флегмонозным аппендицитом. В изменении активности ГТ отмечались следующие особенности: в острый период воспалительного процесса активность фермента снижалась при гангренозной и катаральной формах аппендицита в 3,5 раза, при флегмонозной форме – в 2,6 раза, у больных с абсцессами и флегмонами конечностей – в 3,2 раза по сравнению со значениями у здоровых доноров. В стадию клинического выздоровления активность ГТ у всех пациентов повышалась по сравнению с острым периодом, но оставалась достоверно ниже величин контроля (р<0,05). Подобно ГП, ГТ в ходе катализируемых реакций активно использует свободные SH-группы глутатиона, но не как регенерируемого донора электронов, а в качестве реагента в реакциях коньюгации с различными токсинами и продуктами ПОЛ.

 Глутатион дополнительно расходуется в ходе ряда иных окислительно-восстановительных реакций как поставщик SH-групп. Вследствие высокого расхода глутатиона, увеличивается нагрузка на ГР, которая переводит окисленную форму глутатиона в восстановленную. В нашем исследовании концентрация восстановленной формы глутатиона в эритроцитах у больных уменьшалась при катаральном воспалении аппендикса – в 2,3 раза, при гангренозном и флегмонозном аппендиците, флегмонах и абсцессах конечностей – более чем в 3 раза по сравнению с таковой у здоровых доноров. Вследствие высокого расхода глутатиона при «окислительном стрессе», увеличивается нагрузка на ГР, однако, активность данного фермента была меньше, чем у здоровых лиц, при остром воспалении аппендикса в 3,5–5,0 раз, а при острых флегмонах и абсцессах конечностей – в 3,0 раза. На стадии клинического выздоровления активность ГР возрастала (р<0,01), оставаясь ниже аналогичных значений у здоровых доноров, что не могло обеспечить нормализации уровня глутатиона, который по-прежнему был меньше контрольных величин (р<0,01). В целом, содержание глутатиона в эритроцитах снижалось параллельно с ингибированием активности глутатионзависимых ферментов АОЗ – ГП, ГТ, ГР, что свидетельствовало о выраженном угнетении восстановительного потенциала этих клеток.

Таким образом, избыточное накопление продуктов ПОЛ  у пациентов с острым аппедицитом, флегмонами и абсцессами конечностей приводило к мобилизации и последующей деградации ферментативных антиоксидантов эритроцитов и плазмы крови, создавая их дефицит в организме, что не зависело от локализации очага острого воспаления. Проявления дефицита антиоксидантов усиливались с углублением выраженности воспалительного процесса. В период клинического выздоровления проявления указанного дисбаланса в системе глутатиона компенсировались незначительно.

Для оценки степени  и направленности изменений окислительного метаболизма при острых воспалительных заболеваниях хирургического профиля целесообразно проводить комплексное исследование состояния системы глутатионзависимых ферментов в плазме и клетках крови[14, С.343].

2.3. Глутатион:  роль в антиоксидазной защите

Восстановленный глутатион (GSH) - это трипептид, гамма-глутамил- цистеин-глицин, наиболее представленный во всех клеточных системах млекопитающих  низкомолекулярный тиол. Его внутроклеточная  концентрация обычно около 0,5 мМ, но иногда достигает 10 мМ ( Al-Turk et al., 1987 ). Для восстановленного тиола характерны активная тиоловая группа и гамма-глутамиловая связь, что делает его устойчивым к воздействию пептидаз. Его многосторонность проистекает из химических свойств и позволяет быть обновременно как нуклеофильным агентом так и активным восстановителем, взаимодействуя с многочисленными электрофильными и окисляющими компонентами, такими как Н2О2, О2-. и .ОН. Как активный восстановитель GSH играет важную роль в процессах детоксификации . Это ликвидация разрушений , вызванных перекисью; это подтверждается истощением по GSH, что увеличивает восприимчивость животных к цитотоксинам и оказывает эффект на воздействие лекарств при опухолевых заболеваниях.

Восстановленный глутатион  легко реагирует со свободными радикалами, среди которых необходимо отметить гидроксильный и углеродный радикалы, отдавая атом водорода. Подобные взаимодействия обеспечивают защиту, нейтрализуя активный .ОН, считающийся наиболее опасным среди свободных радикалов. Было предложено существование GSH-зависимого фактора, подавляющего пероксидацию липидов в мембранах ( Burk, 1990 ). Подобное ингибирование может быть связано с каталитическим преобразованим витамина, включая образование GSH .

Как и для большинства  антиоксидантов, количество GSH меняется при различных физиологических  изменениях, включая возраст и некоторые опухолевые заболевания, обычно сопровождающиеся возрастанием количества пероксидов жиров ( Farooqui et al., 1987 ). Существует ли обратная связь между снижением содержания GSH и повышением уровня пероксидации еще не установлено. Некоторые исследования ( Farooqui et al., 1987 ) показали, что снижение с возрастом уровня GSH может быть связано либо с возрастным увеличением скорости окисления или со снижением тотального количества GSH, что в свою очередь может быть вызвано или усилением его деградации или снижением биосинтеза. Биосинтез GSH катализируют глутамилцистеин синтетаза и GSH синтетаза .

Т.к. гамма-глутамилтрансфераза локализована в плазматической мембране и ее активный центр обращен во внеклеточное пространство, скорость оттока клеточной GSH, по-видимому, определяет ее степень деградации. Усиление деградации GSH , как можно предполагать, нарастает вместе с увеличением количества пероксидов с возрастом. Поэтому, возможно, что накопление токсичных веществ в процессе старения вызывает активацию таких ферментов как GSH пероксидаза и трансфераза,что приводит к истощению внутриклеточного GSH  [15,C.45-48].

2.4. Глутатионпероксидаза

Глутатионпероксидазы (ГП, англ. Glutathione peroxidase, PDB 1GP1, (КФ 1.11.1.9) — семейство ферментов, защищающих организм от окислительного повреждения. Глутатионпероксидазы катализируют восстановление перекисей липидов в соответствующие спирты и восстановление пероксида водорода до воды. Известно несколько генов, кодирующих разные формы глутатионпероксидаз, отличающиеся по локализации в организме. Структурно ферменты данного семейства представляют собой селеносодержащие тетрамерные гликопротеины.

Рисунок 5. Глутатинопероксидаза 1

Глутатионпероксидаза служит катализатором реакции восстановления перекисных липидов с помощью глутатиона и в огромной степени ускоряет этот процесс. Глутатион же является центральной фигурой в этой реакции, но при этом сам переходит в окисленную форму.

Окисленный  глутатион практически сразу  же восстанавливается под действием  фермента глутатионредуктазы и вступает в реакцию с новыми молекулами пероксидов. В результате такого процесса окисленные липиды полностью восстанавливаются или превращаются в менее токсичные соединения. Весь глутатион-ферментный комплекс предотвращает поврежде-ние клеточных оболочек вследствие разрушения липидных молекул свободными радикалами.

Глутатионпероксидаза, так же, как и СОД, является по своей структуре белком-металлоферментом. Для ее выработки необходим селен, причем в достаточно больших количествах, так как каждая молекула ГПО содержит 4 атома селена. При недостаточном количестве селена вместо ГПО образуется глутатион-S-трансфераза, которая разрушает только перекись водорода. Тоже нужная штука, но ГПО она не заменит.

При дефиците селена у нас нет и глутатионпероксидазы, а значит, открывается громадная брешь в обороне от оксидативного стресса и связанных с ним болезней - атеросклероза, сердечно-сосудистых заболеваний, ревматоид-ного артрита и катаракты.

Так же, как и СОД, глутатионпероксидаза - это не один фермент, а целое семейство (у человека установлено наличие 8 видов глутатионпероксидаз). Важнейшие из них работают в цитоплазме и клеточных митохондриях, другие - в крови и кишечнике.

ГПО является одним из важнейших звеньев антиоксидантной  защиты организма. Для клетки в целом активность глутатионпероксидазы значительно важнее, чем других антиоксидантных ферментов. Так же, как и каталаза, ГПО способна разрушать и перекись водорода, но она более чувствительна к низким концентрациям H2O2, которые возникают чаще. В некоторых тканях (клетки мозга, сердце) каталазы почти нет, поэтому глутатионпероксидаза играет там роль основного антиоксидантного фермента.

Наибольшее  количество глутатионпероксидазы сосредоточено  в печени, эритроцитах, надпочечниках. Значительное ее количество содержится в нижних дыхательных путях, где она нейтрализует поступающие из внешней среды озон, окись азота и другие активные вещества.

Активность  глутатионпероксидазы в организме  во многом определяет динамику патологических процессов. При снижении активности ГПО нарушается защита клеток печени от алкоголя и опасных химических веществ, значительно повышается риск возникновения онкологических заболеваний. В настоящее время глутатионпероксидаза рассматривается как перспективное средство предотвращения рака.

При низкой активности ГПО и низком уровне селена возможно возникновение бесплодия, развитие ревматоидного артрита  и других заболеваний. Помимо селена, активность глутатионпероксидазы зависит  также от содержания в организме  витаминов А, С и Е, серосодержащих аминокислот и, естественно, глутатиона. По некоторым данным, необходимы также витамины группы В - ниацин (никотинамид) и рибофлавин.

Необходимо  также учитывать роль микробиоты (полезной кишечной микрофлоры) в метаболизме  всех металлозависимых ферментов: каталазы, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы. Кишечная микрофлора или напрямую участвует в их производстве, или подготавливает процессы ферментирования. Так, например, никто иной, как кишечные микробы, присоединяет к молекуле глутатиона четыре атома селена, которые образуют молекулу ГПО[16,17].

2.5. Система  глутатиона и множественная лекарственная  устойчивость

Глутатион (GSH) –  трипептид, синтезируемый в организме  из глутаминовой кислоты, цистеина и  глицина (рис. 6). Важнейшими функциями  глутатиона являются антиоксидантная, иммунопротекторная и детоксификационная. Нарушение регуляции метаболизма глутатиона может стать причиной возникновения злокачественных опухолей. Повышенное количество глутатиона обнаруживается в клеточных линиях, резистентных к алкилирующим соединениям (эмбихину, хлорбутину, мелфалану, циклофосфамиду и др.). Химические взаимодействия между глутатионом и алкилирующими соединениями катализируются группой ферментов глутатион-S-трансфераз (GST), разные изоформы которых, вероятно, взаимодействуют с разными препаратами, повышая степень детоксикации лекарств. Таким образом, активация этих ферментов может определять резистентность клеток к лекарствам (Ставровская, 2000; Wang, Xiao, 2012).

Рисунок 6. Глутатион (γ-глутамилцистеинилглицин)

Было показано, что уровень GSH в клетках лейкоза Р388, резистентных к циклоплатаму (амин(цилопентиламин)-S-малатоплатине (II)), был почти в 10 раз выше, по сравнению с родительскими клетками этой линии. При этом активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы была в 2 раза, а GST – в 1,5 раза выше в клетках резистентного штамма по сравнению с чувствительным. Введение циклоплатама мышам-опухоленосителям вызывало значительное увеличение уровня GSH в опухолевых клетках обоих штаммов, тогда как изменения в активности GSH-зависимых ферментов были выражены в меньшей степени. Полученные результаты свидетельствуют о том, что GSH-зависимые ферменты могут вносить существенный вклад в лекарственную устойчивость клеток лейкоза Р388 к циклоплатаму (Дедерер и др., 1995).

Ферменты, катализирующие синтез глутатиона в клетке, также могут иметь отношение к лекарственной устойчивости, однако их роль в МЛУ опухолевых клеток исследована недостаточно. С изменениями системы GSH может быть связана резистентность клеток не только к алкилирующим агентам, но и препаратам круга Pgp-МЛУ (антрациклинам и винкристину). Последнее указывает на то, что существуют общие механизмы регуляции mdr-генов и генов, участвующих в метаболизме глутатиона (Невзглядова, Шварцман, 1992).

Было показано, что в клеточной линии MCF7, резистентной к 4-нитрохинолин-1-оксиду (4-NQO) наблюдаются сверхэкспрессия Pgp и повышение активности GST. При этом такая синергетическая резистентность к 4-NQO связана с GST-зависимым увеличением образования 4-NQO-глутатион-коньюгатов, которые выводятся из клеток с помощью Pgp. Последнее необходимо для обеспечения полной защиты клеток от 4-NQO-токсичности (образования аддуктов с ДНК и цитотоксичности) (Morrow et al., 1998, 2000).