Исследование антиоксидантной и антирадикальной активности меланиновых пигментов

Для изучения влияния меланина на интенсивность ПОЛ, индуцированного  этими двумя системами, к каждой пробе добавляли определенный объем 1%-ого меланина, а также проводили  преинкубацию меланина с Fe²⁺ (100мМ FeSO₄) и Cu²⁺  (100мМ CuSO₄) в течение 15 минут.

Для определения  спонтанного уровня перекисного окисления лецитина лецитин (5 мг/мл) в фосфатном буфере.

Все пробы  инкубировали на водяной бане в течение 30 минут при  37 ⁰С.

Затем добавляли по 2 мл 0,8% ТБК во все пробы, после чего кипятили пробирки на водяной бане 15 минут. Охлаждали до комнатной температуры. Центрифугировали 10 минут при 4000 g. Измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости с помощью спектрофотометра “Solar PV 1251 c”, λ=532 нм.

 

2.2.6. Перекисное окисление лецитина, индуцированное УФ-излучением

0,5 мл 1% лецитина, растворенного в хлороформе и  этаноле в соотношении 1:1, добавляли к растворам 1%-ого меланина различной концентрации, доводили фосфатным буфером и облучали на УФ-лампе (λ=254 нм) в течение 5 и 15 минут. Для определения уровня спонтанного ПОЛ к раствору лецитина добавляли только фосфатный буфер (по 0,5 мл раствора лецитина и фосфатного буфера) и помещали растворы под ультрафиолет на 5 и 15 минут.

Все пробы  инкубировали в течение 30 минут при 37 ⁰С на водяной бане.

Добавляли по 2 мл 0,8% ТБК во все пробы, после чего кипятили пробирки на водяной  бане 15 минут. Охлаждали до комнатной  температуры. Центрифугировали 10 минут  при 4000 g. Измеряли оптическую плотность полученных растворов с помощью спектрофотометра “Solar PV 1251 c”, λ=532 нм. В качестве контроля использовали фосфатный буфер.

 

2.2.7. Измерение активности СОД в реакции аутоокисления кверцетина

Реактивы:

1. Кверцетин в ДМСО – 1,5 мг/мл – 0,46 мМ
2. Фосфатный буфер (0,02 М, рН 7,8):

Na₂HPO₄*12H₂O (0,2 M) – 18,3 мл;

NaH₂PO₄*2H₂O (0,2 M) – 1,7 мл;

3. ЭДТА – 0,08 мМ в фосфатном буфере;
4. ТЕМЕD.

После смешивания двух солей для приготовления  фосфатного буфера объем доводили до 200 мл дистиллированной водой, потом  разбавляли  в 5 раз и добавляли  ЭДТА. Непосредственно перед работой  добавляли 0,2 мл TEMED.

Ход работы:

В опытную  пробирку вносили 0,1 мл кверцетина и 1% р-р меланина в различных концентрациях и доводили объем реакционной смеси фосфатным буфером до 3,2 мл.

Измерение проводили на спектрофотометре “Solar PV 1251 c” при λ=406 нм на нулевой и двадцатой минуте протекания реакции, соответственно до и после окисления.

В качестве положительного контроля использовали смесь буфера и меланина, а в качестве отрицательного контроля – кверцетин в буфере и 0,01 н NaOH. Процент ингибирования рассчитывали по формуле:

%=((D_к-D_пр)/D_к)*100% 

D_к (D_пр) = D₂₀ – D₀

D_к – оптическая плотность контроля;

D_пр – оптическая плотность опытной пробы;

D₀ и D₂₀ – оптическая плотность, измеренная на 0 и 20 минуте соответственно. [16]

 

8. Реакция пероксидазного окисления аминобифенилов [11]

Реактивы:

1. 0,1 М цитратно-ацетатный буфер, рН 5,5
2. Пероксид водорода 0,01М
3. 3,3’ – диметоксибензидин (о-ДА), 0,01 М (раствор о-ДА готовится в 50% ДМФА)
4. Пероксидаза хрена. (Концентрированный препарат пероксидазы 10^-4 –10^-5 моль/л хранится в морозильнике в 50% глицерине. Перед работой готовится рабочий раствор 10^-8 – 10^-9 моль/л. Концентрация фермента рассчитывается  с использованием значения коэффициента молярной экстинкции при 403 нм – ε= 102 мМ^-1 см^-1. Каждый день готовится новый рабочий раствор. Препарат фермента хранится на льду).

 

Ход работы:

В пробирки вносили по 2,2 мл 0,1 М  цитратно-ацетатного буфера (pH=5,5) и по 200 мкл о-ДА(0,01 М).

Добавляли 10 мкл пероксидазы хрена (концентрация 10^-9 моль/л), перемешивали.

Инкубировали при 30 ^oC 4 минуты. 

Измеряли оптическую плотность  при 460 нм. Запускали реакцию добавлением 100 мкл 0,01 М перекиси водорода. Одновременно начинали отсчет времени.

За ходом реакции следили  по накоплению окрашенных продуктов  реакции. Измеряли  оптическую плотность  через каждые 15 секунд в течение 3-5 минут.

Строили график зависимости концентрации продукта перекисного окисления  о-ДА от времени.

Концентрацию рассчитывали по формуле:

С=А/ε *l, где ε = 3*10⁴ см^-1М^-1, а l=1см 

Находили начальную скорость реакции  пероксидазного окисления: V=ΔC/Δt

Изучали зависимость скорости пероксидазного окисления о-ДА от различных концентраций Fe²⁺; Fe²⁺, проинкубированного с 1%-ным меланином в течение 15 минут.

Изучали зависимость скорости пероксидазного окисления о-ДА от различных концентраций Cu²⁺; Cu²⁺, проинкубированного с 1%-ным меланином в течение 15 минут.

Строили графики зависимости концентрации продукта от времени при различных  концентрациях Fe²⁺ и Cu²⁺ в среде. Определяли начальные скорости реакций. [11]

 

 

 

9. Статистическая обработка результатов

Статистическую  обработку проводили с использованием методов вариационной статистики для  малых выборок. Результаты представлены в виде ± S, где – среднее, S - средняя ошибка, а также проведен анализ достоверности отличий с использованием уровня значимости р, исходя из правила, что различия достоверны при р0,05.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 3. Результаты и их обсуждение

Нами было изучено влияние меланина на интенсивность ПОЛ, индуцированного системой Фентона, ионами Cu²⁺ и Fe²⁺; на перекисное окисление липидов в митохондриальной фракции печени крыс, индуцированное Fe/аскорбатной системой; на интенсивность УФ-индуцированного ПОЛ; влияние различных концентраций меланина на процесс аутоокисления кверцетина, сопровождающийся генерацией супероксиданион радикала; на интенсивность свободнорадикальных окислительных процессов (пероксидазного окисления ортодианизидина); изучить влияние меланина (нативного и в комплексе с ионами железа и меди) на процесс пероксидазного окисления о-ДА.

Первоначально мы изучили спектральные свойства меланинового пигмента в присутствии различных химических факторов, способных окислять и восстанавливать полимеры.

 

1. Изучение спектральных свойств меланина

Меланин поглощает как ультрафиолет, так  и видимый свет. Поглощательная способность  убывает линейно в диапазоне  от 620 до 720 нм, а затем экспоненциально  при более коротких длинах волн (300 – 600 нм).

Фотоокисление и полимеризация меланина были хорошо проиллюстрированы при описании воздействия ультрафиолета на кожный пигмент. Возможно, что одна форма  меланина с низким молекулярным весом (или полимерный предшественник меланина) превращается в другую форму с  более высокой молекулярной массой. [25]

Из литературы известно, что под воздействием ультрафиолета  оптическая плотность меланина экспоненциально  убывает от 350 до 600 нм.  Такое изменение спектральных характеристик зависит как от дозы ультрафиолета, так и от концентрации меланина.[18,25]

Интенсивность светопоглощения зависит от степени окисленности полимера. Чем больше в нем сопряженных двойных связей, альдегидных групп, тем он темнее – тем больше оптическая плотность растворов и интенсивность светопоглощения, и тем меньше светопропускание.

Как и другие ароматические соединения, содержащие  ауксохромные группы,  меланин демонстрирует различные спектры поглощения, зависящие от pH (Crippa, Horak, Protta, Svoronos, & Wolfram, 1989). [34] Влияние pH отчетливо видно на деполимеризованной форме меланина. В то время как, УФ-спектр исходного образца остается неизменным при варьировании  pH. Эта зависимость от pH среды может являться результатом диссоциации фенольных групп в меланине. А это, в свою очередь, ведет к повышению антиоксидантной активности в деполимеризованном меланине.[34]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

На основании  данных, полученных нами при измерении оптической плотности растворов 0,01 %-ого меланина, а также растворов меланина в присутствии окислителей и восстановителей были построены следующие спектры поглощения меланина (рис.4 – 8):

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис.4. Спектры поглощения 0,01% раствора меланина в 0,01 Н NaOH , растворов меланина после облучения УФ в течение 5 и 15 минут, СФ-46, λ=340-620 нм, l =1см   

Примечание I - здесь и далее: результаты достоверны при Р ≤ 0,05.

        меланин

        меланин, облученный в течение 5 мин

        меланин облученный в течение 15 мин

 

Как видно  из спектров, представленных на рис.4, облучение УФ в течение 5 минут не приводит к существенному изменению спектральных характеристик меланина, а облучение в течение 15 минут способствует уменьшению оптической плотности при λ=450 нм на 0,1 опт. ед. Это может быть связано с нарушением структуры полимера, с изменением системы сопряжения двойных связей.

 

 

 

 

Рис.5. Спектры поглощения 0,01% раствора меланина в 0,01 Н NaOH, раствора меланина с дитионитом натрия, СФ-46, λ=340-620 нм, l =1см

       меланин

      меланин с дитионитом натрия

Как видно  из спектров, представленных на рис.5, в результате взаимодействия с дитионитом натрия происходит увеличение оптической плотности в диапазоне 370 – 600 нм. Это может быть связано с тем, что дитионит натрия (Na₂S₂O₄) восстанавливает хиноны до гидрохинонов в структуре меланина.

 

Рис.6. Спектры поглощения 0,01% раствора меланина в 0,01 Н NaOH с дитионитом натрия, с дитионитом натрия после облучения УФ в течение 5 минут, СФ-46, λ=340-620 нм, l =1см

      меланин

      меланин с дитионитом натрия

      меланин с дитионитом натрия, облученный УФ в течение 5 мин

      

Как видно  из спектров, представленных на рис.6, в результате взаимодействия с дитионитом натрия происходит увеличение оптической плотности в диапазоне 370 – 600 нм. А в результате облучения такого раствора УФ изменения оптической плотности в том же диапазоне, по сравнению с необлученной пробой, содержащей дитионит натрия, практически не происходит. По-видимому, воздействие генерализованного УФ-облучения в течение 5 минут на восстановленную форму меланина не приводит к структурным, и, следовательно, спектральным изменениям.

Рис.7. Спектры поглощения 0,01% раствора меланина в 0,01 Н NaOH, раствора меланина с пероксидом водорода, СФ-46, λ=340-620 нм, l =1см

        меланин

      меланин с пероксидом водорода

Как видно  из спектров, представленных на рис.7, в результате взаимодействия меланина с пероксидом водорода происходит уменьшение оптической плотности в диапазоне 340 – 480 нм. Это может быть связано с с увеличением системы сопряжения двойных связей в меланиновом полимере.

 

Рис.8. Спектры поглощения 0,01% раствора меланина в 0,01 Н NaOH с пероксидом водорода, раствора меланина с пероксидом водорода после облучения УФ в течение 5 минут, СФ-46, λ=340-620 нм, l =1см

      меланин

      меланин с пероксидом водорода

      меланин с пероксидом водорода с УФ 5 мин

Как видно  из спектров, представленных на рис.8, наибольшее снижение значений оптической плотности происходит в случае взаимодействия облученного меланина с перекисью водорода. Это может быть связано с окислительной способностью перекиси водорода и воздействием УФ-излучения.

 

 

 

3.2. Изучение влияния меланина на перекисное окисление липидов

Меланины  – это полианионы с относительно высоким содержанием отрицательно заряженных карбоксильных групп и о-семихинонов (Felix et al.,1978; Ito, 1986; €'rota,1992). Вещества с катионными свойствами (например, амины и металлы), таким образом, связываются с меланином путем ионного взаимодействия (Larsson and Tjalve, 1979).[20]

Ионное  связывание  несомненно упрочняется другими силами, такими, как Ван-дер Ваальсово взаимодействие при плотном соединении ароматических колец различных веществ со структурами меланина. Вовлечение взаимодействия, связанного с переносом заряда, было также показано для определенных электрон-донорных веществ, а также в некоторых случаях и гидрофобное взаимодействие. Обычно связывание многостороннее. Анализ показал, что у отдельных веществ, включающих металлы, в связывании с меланином участвует более, нежели одна группа, что указывает на присутствие взаимодействующих механизмов связывания, а также на влияние стерических факторов.[20,36]

Известно, что ПОЛ может инициироваться гидроксильными радикалами, возникающими в результате воздействия на клетку различных факторов, будь то УФ-излучение или же ионы некоторых металлов переменной валентности.

 

3.2.1. Изучение влияния меланина на перекисное окисление лецитина, индуцированное различными факторами

При проведении реакции перекисного окисления  лецитина с использованием различных  систем индукции: системы Фентона и системы с ионами двухвалентного железа – были получены следующие результаты (рис. 9, рис. 10):