Клеткалық инженерия

                                             Клеткалық инженерия

Клеткалық инженерия – клеткаларды өсіру,оларды будандастыру және қайта құрастыру арқылы клетканың мүлдем жаңа типін жасау әдістерін негізінде қалыптасқан биотехнологияның саласы.Клеткаларды жасанды жолдармен будандастырғ,анда,сомалық(жыныстық емес) клеткаларды бір-біріне қосқанда будан геном түзіледі.Будандастырудың бұл тәсілінің мәні мынада:аталық және аналық клеткалар ретінде жыныстық клеткалар  (гаметалар) емес өсімдіктің дене (сомалық)клеткалары қосылады.Олардың алдын – ала протопластарын бөліп алады,белгілі жағдайда олар бір-бірімен қиылысады.Пайда болған сомалық будан клеткалардан кейін регенерация арқылы будан өсімдіктер өсіп шығады.

Протопластарды қосу арқылы будандастыруды әртүрлі атайды:сомалық будандастыру,парасексуальды будандастыру,жыныстық емес будандастыру.Сон-да да, көбінесе бірінші термин қолданылады,ал пайда болған будан сомалық будан деп аталады.

Клетканы қайта құрастыру (реконструкция)-клетканың құрамына кіретін ядроны,цитоплазманы,митохондрияларды,хлоропластарды,хромосоларды бір клеткадан басқа клеткаға көшіру негізінде мүлдем жаңа клетканы жасау.Осындай әрекеттер нәтижесінде ядролық және цитоплазмалық гендер тіркестігі әдеттегідей емес,тіпті өзгеше клеткалар пайда болуы мүмкін.Одан да артық ғалымдарды қызықтыратыны, ол жеке хромосомаларды тасымалдау арқылы анеуплойдтық линияларды алу мүмкіншілігі.

Қазіргі уақытта протопластарды бөліп алу үшін ферменттердің қоспасын пайдаланады. Бұл қоспаның құрамында ферменттердің үш түрі болады:олар пектиназа,целлюлоза,гемицеллюлаза. Олар клетка қабығының негізгі компо-ненттерін ыдыратады.Бұл ферменттерді кейбір бактериялар мен саңырауқұлақтар өздерін өсірген сұйық ортаға бөліп шығарады, сонымен қатар оларды ұлудың ас қорыту сөлінен бөліп алады. Қазіргі уақытта пептиназалық және целлюлазалық әсері бар бірталай стандарттық бірнеше ферменттер бар.Олардың фирмалық аттары әртүрлі, атап айтқанда мыналар:

- Целлюллюлаза;

- Гемицеллюлаза;

- Пектиназа.

Ферменттік ерітінділерді арнайы сүзгіден өткізу арқылы залалсыздандыра-ды.Клетка түрінде құрылымы мен құрамы жағынан айырмашылық болғандық-тан,қолданылатын ферменттердің комбинациялары мен мөлшерінің ара қатынасы бірдей болмайды. Әр-бір ұлпа үшін ферменттердің құрамы,концентрациясы мен ара қатынасы және өңдеу уақыты бөлек іріктеліп алынады.Бөлініп алынған протпластар ферменттік ерітіндіде мейлінше аз уақыт болуы керек,одан кейін ұқыпты түрде жуылуы қажет.

Протопластарды бөлу кезеңінде осмостық стабилизатор маңызды қызмет атқарады.Протопластар бүтін болуы үшін ферменттік ерітінділер изотониялық немесе гипертониялық күйде болуы керек.Кейде материалды алдын –ала плазмолиздік ерітіндісінде біраз ұстайды. Осмостық зат ретінде көбінесе қанттар (глюкоза,сахароза,сорбит,маннит) пайдаланылады. Осмостық қысымның дәл концентрациясы өсімдіктің нақты түрінен және оның физиологиялық күйіне байланысты жеке іріктеліп алынады.Көбінесе ферменттер кейін протопластарды өсіруге қолданылатын қоректік ортада ерітіліп дайындалады.Ферменттік ерітіндінің РН көрсеткішіндегі бір деңгейде (5,4-6,2 ) ұстау үшін буфер қосады.

Протопластарды бөлу кезеңінде аэрацияның маңызы зор. Слндықтан ортаны араластыратын жабдықтар қолданылады немесе ферменттік ерітіндінің түбіне ғана құйылған Петри табақшасында бөліп шығарады.Протопластарды ала көлеңкеде немесе қараңғыда бөліп алады. Ферменттік ерітіндіде инкубация уақыты ферменттердің үйлесуіне, РН және температураға байланыста,1-2 сағаттан 15-16 сағатқа дейін барады.Әрбір нақтылы ұлпа үшін ең тиімді температурамен өңдеу уақытын жеке іріктеп алу қажет. Температура әр деңгейде болады, мысалы бидайда 14 С болса,томатқа ең қолайлысы 27 С.

Протопластар бөлініп алынған соң,олар ұлпаның қалдықтары мен ферменттерден тазалануы керек. Ол үшін оларды центрифугалайды немесе сүзіп алады. Инкубациялық қоспаның тесіктері 50-100 мкм електен сүзеді,одан кейін протоплас суспензиясын центрифугалайды. Центрифугалау тәртібі осмостық затқа байланысты. Егер ферменттік ерітіндісі 0,4-0,5 м сахарозада дайындалса,100-200гр 2-3 минут бойы центрифугалайды. Протопластар үстіне қалқып шығады, оларды Пастер пипеткасымен сорып алып, 2 рет тұздың ерітіндісімен шаяды. Тығыздығы төмен басқа осмостық заттарды (маннит,сорбит)қолданған кезде ,протопластар центрифугалау кезінде тұнба болып шөгеді.Оларды 2 рет жуады. Одан кейін протопластарды тұздың ерітіндісінде немесе 0.4м маннит, сорбит, глюкоза ерітіндісіне нгемесе өсіретін қоректік ортаға салып, суспензиясын алады.

               Соматикалық клеткалардың гиридизациясы

Гибридомалар тұтас екі бүтін жасушалардың бірігуі нәтижеінде жалпы цитоплазманың бір ядросы бар болып жасуша түзіледі. Бірігуге әртүрлі жасушаларқатыса алады: эмбрионалдық және ересек организмнің, қалыпты және қатерлі, белсенді көбеюшілермен бөліну қабілеті жоқтар. Сомалық жасушалар гибридтері гендік қызметімен реттелуін, жасуша жетілдіру механизмдерін, хромосомаларды картирлеуді, қатерлік мәселелерін, сонымен біпге вирустар мен қожайын жасушасының өзара әсерін зерттеу үшін пайдаланылады. Гибридомдық жасушалар маңызды биотехнологияның біреуі үшін - гибридома технологиясы көмегімен моноклоналдық антиденелер алуға негіз болады.

1970 жылы миеломды жасушалды  біріктіру тышқанның гибридомаларын  алу жөнінде алғашқы мәліметтер  пайда болды, сол кезде миеломдық  жасушалардың иммуноглобулин молекулаларының  қалыпты және өзгерген әртүрлі  типтерін шығаратыны белгледі. Гибридтердің  көбісі аналық жсушалардың әрқайсысында  синтезделген иммуноглобуоиндердің  барлық полипептидтерн өндіруді  жлғастыруға болады. Бұл гибридтік иммуноглобулиндер гендернің экспрессиясы кодоминаттық жолмен болатыны жөніндегі қорытындыға әкеледі. Гибридомалармен секрецияланатын көп иммуноглобулиндер екі аналық жасушалармен синтезделетін ауыр және жеңіл тізбектерден тұратын аралас молекулалар болып табылады. Одан басқа, егер гибрид иммуноглобулиндері өндірмейтін линияны, оларды өндіретін линиямен бірктру арқылы алынса, онда антидене синтезі жалғаса береді, басылмайды. Мұндайда гибрид өндіргш аналық жасушалық антиденесін өндіреді.

Жоғары айтылғандар бойынша миеломаның өсірген жсушсы мен иммунизацияланған тышқанның көкбауырлық қалыпты жасушасынан гибрид жасау идеясы туды.

Гибридтік клондарды өсіруде келесі жағдайларды есте ұстау керек. Көкбауырдың брікпеген жасушалары дамуын жалғастырмайды, өйткені олар ұзақ өсіру қабілетін ие емес,. Бірақ миелома жасушалары in vitro өсірудің анық потенциясына ие, тіпті гибридтік жасушаларды шеттету мүмкін. Бұл болмас үшін аналық миеломдық жасушалардың көбеюіне бөгет жасайтын жағдай жасау керек.

Гибридомалардың қалың культурасын алудағы мүмкіндік - зертханалық жануардың асциттк сұйықтығында іште көбейту.

Асцитты алу үшн тышқандрға алдын ала перитонеал ішінде 0,2 мл пристан кіргізеді, 10-14 күннен кейін гибридомалық жасушалар және реципиент организм антигендік гистосыйымдылық бойынша бірдей болуы тиіс: егер гибридомалар гетерогенді болса, онда реципиент иммунологиялы ареактивті болуы тиіс.

Гибридтк жасушалардың біргуі, клондарды алу селективтік ортада жүреді, ГАТ жүйесі деп аталатын да, мұнда аминоптерин аналық жсушаларға керекті фоли қышқылының антагонисті болады. ГАТ ортада аналық миеломдық жасушалар тіршліксіз болады, ал ұалыпты жасушалар өспейді. Егер орта селективтігі ГАТ болуына байланысты болса, онда жоғары қоректік сапаны Игла ортасының немесе 199 негіздің құрамы, сонымен бірге сиыр ұрығының енгізілген сарысуы қамтамасыз етеді. СПК гибридтік жасушалардың клондарының жақсы өсуі мен көбеюіне мүмкіндік береді. Жасушаларды белсенді өсуі мен көбеюін қамтамасыз ету және оларды біріктіру үшін лимфоциттер мен миеломдық жасушалармен қатар селективтік қоректік ортаға қоректендретін қабаттық жсушлар деп аталатын перитониалдық макрофагтар, сирегірек тышанның тимоциттерін, фибробласттарды енгізеді.

Екі әртүрлі линиялардың жасушалары біріккен соң клон түзіледі, иммундық мәнде оны өндіретін антиденелер моноклоналдық болуы мндетті емес, себебі гибридтік клонның әр бір жасушсында екі аналық жсушалардың хромосомалары экспрессиясы көкбаырдың да, миеломдықтың да иммуноглобулиндердің өндіруге әкеледі. Бірақ көбеюдің ерте кезінде гибридтік жасушалар хромосомаларының бөлігін, оның ішінде антидене түзушілерін тез жоғалтады.

Гибридомалардың 10-15% көкбауыр текте иммуноглобулиндерді өндіреді, яғни иммунизациялйтын антигенге арнайы; оларда lg миеломдық ауыр немесе жеңіл тізбектер болайды. Гибридомалар - моноклоналдық антиденелді өндіруші, көкбауыр жасушаларынан антиденелді синтезбен өндіруге қабілетіне ие болады, ал миеломды жсушалардан - шексіз өсу мен туморлықтық қабілеттікке ие. Гибридтік жасушалардың тұрақты клондарын бөліп алу үшін, жртылай сұйық агард лимиттайтын сұйылту жолымен 2-3 реттік клондауды жүзеге асырды немесе ағындық цитофлуоримет приборын пайдалану рқылы.

Гибридомалық жасушалрды сақтау үшін өсіру ортасына, 20% СПК және 10% ДСФ (диметилсульфоксид) араластырады; фильтрлейді, сұйық азотта суытады, әрі қарай гибридомаларды осы ортада қайтадан суспензиялайды, жұмыста пайдаланады.

Гибридомалардың қалығһң культурасын in vitro көбейту арқылы, тндер культурасында немесе ферменттерде суспензиялық жсушаны өсіру жолымен алуға болды.  

                 Моноклоналдық антиденелер технологиясы

Антиденелер немесе иммуноглобулиндер жоғары арнайылы ақуыздар болады, бөтен антигендердің организмге енуіне жауап ретінде В - лимфоциттермен өндіріледі және тек сол антигендермен өзара байланысуға қабілетті. Антигендер есебінде инфекцияны қаздырушылар (бактериялар, өңездер, қарапайымдылар, вирустар), инфекциялық сипатта емес биоорганикалық заттар (бөтен сарысу, өсімдік тозаңшалары, әртүрлі ксенобиотиктер, улар, ферменттер, гормондар, трансплантат жасушалары).

Иммунокомпетентік жасушлар айыратын бөтен антиген организмге енгенде қанда, көкбауырда, лимфотүйіндерде орналасқан және антидене продуцентерінің, бұрынғы жасушалары болатын В - лимфоциттерден плазматикалық жсушалар түзіледі (жетілдіріледі) - антидене және иммуноглобулиндердің нағыз продуценттері (28 - сурет).

Антиденелер немесе иммундық сарысулар алудың классикалық технологиясы бөтен антигендерді зертханалық жануарларға бірнеше рет енгізу болады - гипериммунизция әдісі. иммунизациялнған жануардың қанының сарысуында 10-14 тәулікте жоғары титрлі антиденелер жиналады. Имунизацияланған жануардан сарысуды алып, оны бөгде заттардан тазалайды немесе гамма-глобулиндік фракция бөлінеді; тиісінше иммундық сарысу немесе иммундық гаммаглобулиндер алынады.

Гиппериммунизация әдісімен алынған антиденелер поликлоналды болады. Оның мәнісі, кез-келген бөтен жасуша (микробтық, жануар немесе өсімдік) немесе вирустық бөлшек әртүрлі арнайылы оншақты антигендік детермининттарға ие. Ал организмде әртүрлі В - лимфоциттердің 107-108 клондары болады, олардың әрқайсысы нақты антигенге комплементарлы бір арнайылы антидене өндіреді. Сондықтан, енетін антигендер кешеніне В-лимфоциттрдің әртүрлі клондары әртүрлі арнайылы антидененің тиісті мөлшерлі санын синтездейді, яғни поликлондық, поливалентік сарысу пайда болады.

Поливаленттік сарысудан моноваленттік алу үшін, оны белгілі антигендермен Кастелани ұсынған өңдеу әдісі бар. Мысалы, гиппериммунизацияда антиген есебінде О, К, Н - антигендері бар микроорганизмдердің инактивацияланған жасушаларын енгізген, онда сарысуға тек О мен К антигендерін қосса (олар сарысудан алынып тасталатын антиген-антидене кешендерін түзеп, тек тиісті антиденелермен реакцияға кіріседі), моноваленттік сарысу алынады. Ол тек Н - антигенге қарсы антиденеге ие. Бірақ антиденелдің бір тектілігінің деңгейі, мұндай сарысудың моноклоналдығы жөнінде айту қиын.

Антиденелердің моноклоналдығы жөнінде айтуға болады, егер әуел баста антидене продуценті есебінде тек бір клон, in vitro өсіріп, көбейту қажет, антигенмен белсендіріп, онымен синтезделген антиденені бөліп алған дұрыс. Өкінішке орай, В - лимфоцит, in vitro басқа да кез келген жетілдірілген жасуша секілді 5-10 пассаждан өтіп, әрі қарай өспей, арнайылығын жоғалтады. Қызметтік белсенділігі мен ұзақ жасауын қалай қамамасыз ету керек.

1950 жылдан биологияда  құрамы жағынан бірдей қоректік  ортаны қолданып, in vitro жануар жасушаларын, тіндік культураны өсіру технологиясы пайдаланады. Тек жетілдірілген жаушаларды ғана емес, атиптік жасушалар, соның ішінде антидене өндіретін плазмоцитомаларды да өсіреді.

Жануар мен адам жасушасының культуралары жалпы биология, цитология, генетика, вирусология, иммунология және инфекциялық патологияның ғылыми мәселелерін шешу үшін қолданады. Ғылыми зерттеулерлің бағыттарының біреуіне әртүрлі жасшаларды біріктіру жатады. Плазматикалық мембранамен қоршалған жасуша фрагменттерін біріктіру арқылы (ядро, цитоплазма, хромосомалар) жаңа, табиғатта бұрын болмаған гибридтік жасуша жасауға болады.

Моноклоналдық антиденелер технологиясында басты позицияға гибридома алу жатады. Оларды алу тарихы мынадай. Молекулярлық биолог Милстайн егеуқұйрық пен тышқанның миеломдық жасушаларын біріктіру жөнінде тәжірбиелермен айналысты, оның ғылыми көмекшісі Келер иммуноглобулин синтезін кодтайтын гендер мутациялары үдерісін, иммундық жауапта антиденелдің вариабелдігін зерттеді. Келердің ойынша мутациялық өзгерістерді зерттеу үшін, бір арнайылы антиденелерді синтездейтін жеке алынған клон, бөлінген клон идеалдық нысана болар еді. Келер миеломдық жасушаларды біріктіру техникасын меңгеріп, белгілі антигенге антидене секрециялайтын жасушалардың клонын алумен шұғылданады. ол миеломдық жасушаны белгілі антигенмен бұрын қатынасы болған популяциядан алынған В-лимфоциттер клонымен біріктіруді жобалады. Осындай жолмен бірігіп алынған жасуша бір арнайылы антиденелерді синтездеп, сонымен бірге қатерлі миеломдық жасуша секілді шексіз өсу қабілеттілікке ие болуы тиіс. 1974 жылдың аяғында Келер миеломдық жасушаларды және қойдың эритроциттерімен иммундалған тышқанның көк бауырының лимфоциттерін біріктіріп, химерлік жасуша алды. Антидене түзуші және ісіктік жасушалардың бірігуімен алынған жасушалар - химерлерді гибридомалар деп атай бастайды.