Клеткалық инженерия

Антиденелерді алудың классикалық тәсілі берілген антигенмен зертханалық жануарларды гипериммунизациялау болады. Бірақ классикалық тәсілімен алынған сарысулар елеулі кемшіліктерге ие, ол жөнінде жоғарыда айтылды. Оған, біріншіден, сарысуда тек берілген антигенге ғана антидене болмайды, басқа да антидене болатыны мүмкін. Екіншіден, таза антиденелерді алу үшін антигенді тазалау қажет, бұл тапшылқ антигендер (гормондар, ферменттер) үшін техникасы күрделі. Одан басқа, кез келген антиген - бұл биополимер емес: антигендік арнайылы детерминанттық топтар деп аталатын белгілі бөліктер ған ие. Жануарларды иммунизациялау үшін, керекті мөлщерде олрды бөліп алу үлкен технологиялық қиындықтармен байланысты. Ал гетерогендік қоспаларды енгізгенде әртүрлі арнайлы антиденелер түзіледі; қосымша қоспалар иммуногендік жағынан қажетті антигенге қарағанда күштірек болуы мүмкін.

Моноклоналдық антиденелерді алу технологиясы, гибридомдық технология.

29, 30 суреттерде моноклоналдық антиденелерді алудың гибридома технологиясы көрсетілген.

 

Моноклоналдық антиденелерді бөлу мен тазарту.  

Моноклоноалдық антиденелерді қоректік сұйықтықтан (егер гибридомалар in vitro көбейтсе) немесе асциттік сұйықтықтықтан (егер гибридомаларды зертханалық жануарлардың іш қуысында көбейтсе) бөліп алады.

Гибридтік жасушалар in vitro моноклоналдық антиденелерді өте көп көбейткенде өсудің логарифмдік фазасында 4-5х105 кл/мл ұсталып тұрады; қоректік сұйықтықта антиденелердің құнарлығы 10-100 мкл/мл құрайды.

Антиденелер in vitro көбейгенде асцитті алу үшін, тышұандарға іш қуысына алдын ала 0,5 мл пристан енгізеді, ал антидене құнарлығы (титрі) қоректік сұйықтықтағы титрден 100-1000 есе асады.

Құнарландыру мақсатында моноклоналдық антиденелерді препиципитациялайды, аммоний сульфатымен тұздап, тұнбаға түсіреді; тазалау үшін аффиндік немесе ион алмасу хромотографиясы қолданылады.

Антиденелер арнайлылығын анықтау үшін әртүрлі серологиялық реакциялар - иммуноферменттік анализ, иммунофлюресценция реауциясы, т.б. пайдаланылады.

Алынған моноклоналдық антиденелер барлық шамалары бойынша бірдей - иммуноглобулиндер молекулалар класы, оның типі, арнайлығы, аидтігі, аффиндігі бойынша.

Моноклоналдық антиденелерді қолдану

• Серологиялық реакцияларда инфекциялық аурулардың диагностикасы үшін тест - жүйелерді дайындау (ИФА, РИФ, РИА және басқа)
• Гемотологиялық тәжірбиеде гемопоэздік жасушалардың бетік маркерлерін сәйкестендіру және гематологиялық аурудың дамуын тудыратын малигнизацияланған жасушалар мен қалыпты жасушалардың субпопуляцияларын белгілеу үшін;
• Аллогендік жілік майын трансплантацияланғанда донорлық жасушаларды "трансплантат қодайынға қарсы" реакцияны болдырмау үшін Т-лимфоциттерге қарсы моноклоналдық антиденелермен өңдейміз;
• Дәрілік заттар молекулаларын тек белгілі жасушалар, мысалы ісіктік жасушалар бетінде орналасқан ақуыздарға қатысты арнайы моноклоналдық антиденелерге қосу дәрілік затарды жеткізуін жеңілдетеді.
• Осы күнге фармоөндірісінде моноклоналды антиденелер дәрілік препараттарды тазалау үшін қолданылады;
• Әртүрлі иммундық реттеуші қызметтерге ие білікті жасушалар, әсіресе Т-лимфоциттер субпопуляцияларының антигендік құрылымын айқындауға. Одан әрі, иммунды - реттеуші гормондарды - интерлейкиндер, интерферондар және т.б. моно - және лимфокиндерді зерттеу.

 

                                    Діңгекті жасушалар

Діңгекті жасушалардың кейбір тканьдерінде бар екені теориялық түрде болжанған болатын. Американдық цитолог Э.Вильсон 1896 жылы сперматогенездің сүйемелдеуін қамтамасыз ететін діңгек жасушалардың айтқан. Эксперименталді әдістердің кемеліне жетпеуіне байланысты діңгекті жасушаларды зерттеу көп уақытты алды. Ең алдымен діңгекті жасушаларды ұрық торшаларының ортақ массасынан бөліп алу керек болатын, бұның өзі оңай жұмыс еді.  

Діңгекті жасушалар (стволовые клетки); (cytos trunci; лат. truncus — бағана, діңгек; грек, kytos — жасуша) - маманданбаған, сирек бөліну арқылы сан тұрақтылығы өздігінен реттеліп отыратын жас жасушалар популяциясы. Бұл жасушалардың ұрпақтары белгілі бір микроортада әртүрлі бағытта жетіліп, бір-бірінен құрылыс айырмашылықтары бойынша ажырап, әртүрлі жасушаларға айналады. Жануарлар эмбриогенезінде діңгекті жасушалар сарыуыз қапшығының қабырғасындағы мезенхима жасушаларынан дамып жетіліп, көпмүмкіндікті (полипотентті) жасушаларға айналады. Діңгекті жасушалар — жануарлар организмінің жасына қарамастан, эр уақытта бөлінуге қабілеттілігін жоғалтпайды, яғни бөлінуге бейім; бірнеше бағытта жетіліп, ұрпақтары әр- түрлі жасушаларға айналады.

Діңгекті жасушалар екіге бөлінеді: эмбрионалді діңгекті жасушалар (ЭДЖ) және аймақтық діңгектік жасушалар (АДЖ). ЭДЖ бластоциста кезеңінде эмбриондардан бөлініп алынса, АДЖ эмбриондардан кейінгі кезеңдерден бөлініп алынады немесе үлкен түрлердің мүшелерінен алынады. Сондықтан оларды кейде ересек діңгекті жасушалар деп аталады. Ересек организмдердің әртүрлі мүшелері мен тканьдерінде пісіп және керекті клеткаға айналуға дайын тұрған ішінара жетілген діңгекті жасушалар кездеседі. Оларды бласттық клеткалар деп атайды. Мысалы мидың ішінара жетілген клеткалары - нейробласт, сүйек клеткасы  - остеобласт деп аталады және т.б.

Бір организмның барлық клеткаларының геномы ұқсас екені мәлім. Бірақ олардың жұмыс тәртібі әртүрлі. Демек, бір организмдегі бүкіл клеткаларының ДНҚ-сы, сонымен қатар діңгек жасушалардыкі де бірдей. Сүйек клеткасы мен нерв клеткасы бір-бірінен қосылған жіне өшірілген гендермен, яғни гендердің әртүрлі экспрессиялануымен ерекшеленеді. Бұндай реттеудің механизмі өте көп, соның бірі - ДНҚ метилилирленуі.

Көпклеткалы организмдер өздерінің гендерін РНҚ - интерференция арқылы өндіруді үйренген. РНҚ - интерференция арқылы жүргізілген жұмыстар ең алғаш 1997 жылы жүргізілді, ол туралы 1998 жылы "Natura" журналында жазылған  болатын.  Көрсетілген ингибация механизмі өте ежелгі болып келеді.

Бұл мезанизм негізінен біркелкі бірнеше миллиард, жерді жаңадан бактериялар басып жатқанда қалыптасқан болатын. Оның көмегімен олар вирустардан және өсімдіктер, сосын адамдар және жануарлар да үйренді.

Сонымен, функционалды гендердің экспрессиялануына РНҚи қатысады және хроматиннің тұрақтануына көмектеседі. Бұл жаналығы үшін 2006 жылы американ ғалымдары Э.Файр мен К.Мело Нобель сыйлығын иеленді. Өсімтал және өсімтал емес клеткалардың ашылуына байланысты, клеткаларды басқарудың жаңа деңгейі ашылды.

Барлық деңгекті жасушалар өздеріне тән қасиеттерімен ерекшеленеді. Олар мамандандырылған, яғни ешқандай тканеспецификалық таңбалағыштары болмайды. Оларды ұзақ уақыт бойы культивирлеуге болады.

Өсімтал клеткалардың діңгекті клеткалардан айырмашылығы, біріншілердің бөліну кезінде шектелген саны болады. Діңгекті жасушалардың жетілу процессі бірнеше кезеңдерден тұрады, бұл организмде діңгекті жасушалардың популяциясына әкеледі. Клетка өсімтал болған сайын, оның басқа тип клеткасына айналу мүмкіншілігі төменірек болады.  

Ересек организмнің мамандырылған клеткаларының эмбриогенезді қайталау қабілеттілігін жоғалтады. Культивирлеу кезінде көптеген мамандандырылған клеткалар фенотипін және өзіне тән функцияларын жоғалта отырып тез дедиферленеді. Дифференделгендерден діңгекті жасушаларды алу әдісі әлі ғылымға белгісіз болып отыр. Дегенімен, діңгекті жасушалар клеткаларының трансдифферендену процессінің арқасында алуға мүмкіндік  бар.

Бірақта ересек тканьдердің сомалық клеткаларының толықтай репрограммирленуі техникалық жағынан мүмкін емес болып отыр. Соматикалық клеткалардың геномында репарация "программасы" болмайды.

Діңгекті жасушаларды зерттеу барысында РНҚи - дан басқа, молекулярлы - биологиялық тұрғыларғы: генетикалық трансформация, биочип техникасына және т.б. мән берілді. 

 

Эмбрионалді діңгекті жасушалар

Кез-келген көпжасушалы организмнің бастамасы зигота - клеткасы болып табылады. Ол екі жыныс клеткаларының, яғни аталық және аналық клеткаларының құйылысуы болып табылады. Бәрақ та ересек организмнің өзінде ЭДЖ болады.

ЭДЖ маңызды қасиеттерінің бірі олар мамандандырылған болмайды, бірақ та 200 клеткалар типінен біреуін таңдап ала алады. Бұдан, әрбір эмбрионалді клетка керекті мамандандырылған клеткаға айналу үшін оларға бір ерекше сигналдың жетіп жатқандығын білдіреді.

Эмбрионалді клеткаларды зерттеу діңгекті жасушалардың тұжырымдамаларынан басталды. Ең алғаш "діңгекті жасушалар" терминін 1908 жылы Берлин қаласында ғылымға ұсынған орыс гистологі А.Максимов болатын. XX ғасырдың діңгекті жасушаларды зерттеуде көптеген жаңалықтарға ашылды. 1981 жылы ағылшын ғалымы М.Эвансқа ең алғаш рет диффернцерленбеген діңгекті жасушаларды тышқан ұрығынан алған болатын. Тек 1998 жылы америка ғалымы Д.Томпсон мен Д.Герхарт адамның ЭДЖ-сын алды. 1999 жылы "Science" журналы ЭДЖ ашылуын биология ғылымындағы үшінші жаңалық деп таныды.

Зерттеулер жүргізіле келе ЭДЖ-ның клиникалық практикада қолданылу кезеңдері құрасытырылды:

- ЭДЖ-ның бөлінуі және  оларды клетка культурасы түрінде  алу;

- олардың функционалді  тиімділігі мен жануарларға қауіпсіз  екендігіне  зерттеулер  жүргізілді;

Дегенімен ЭДЖ-ны бөліп алу әдісі 20 жыл бұрын анықталған. Қазіргі кезде ғалымдар ЭДЖ-ны плацент және май тіндерінді бөліп алу әдістерін іздеуде.

ЭДЖ-ны клиникада табысты қолданғаны жайлы мәліметтер азақ. Академик М.А.Пальцев айтқандай, ЭДЖ-ны ауруларды емдеуде қолданудың бірнеше қиындықтары бар:

- клетклардың бір-біріне  сәйкес келмеуі;

- in vitro және in vivo шарттарының сәйкес келмеуі;

- ЭДЖ-ны қолдану қауіпсіздігі  және тиімділігі туралы мәліметтердің  аздығы;

- ЭДЖ-ны тасымалдау ауру  адамды емдемейді, оның өмірін  ұзартады;

ЭДЖ транплантациясы кезіндегі негізгі проблеманы - иммунологиялық келіспеушілікті генетикалық инженерия арқылы шешуге болады. Бірақ ЭДЖ-ның иммундық мінездемесін өзгерту арқылы емделушіге 100% қауіпсіздікті қаматмасыз ету мүмкін емес. Бұл жерде генетикалық өзгерістердің болуы әбден мүмкін. Тіпті оларды трансплантацияға дейін анықтау қиын.

ЭДЖ диффенциясына көптеген факторлар әсер етеді, және де барлық қажетті жағдайларды орындау мүмкін емес.

Дамып жатқан эмбриондарды клеткасы тотипотентті, бірақ бұл қасиетін олар бірнеше рет бөлінген соң жоғалтады. Кейбір организм клеткалары толығымен дифференциялданбайды, плюрипотентті болып қалады, яғни организмге жеке клеткаларды береді. Тотипотентті эмбриондардың клеткаларын ЭДЖ деп, ал плюрипотентті және мультипотенттілерді ересек діңгекті жасушлар  деп атайды. Ересек діңгекті жасушалар организмге өлген клеткалардың орнын толтыру үшін қажет.

АДЖ тін (ткань) зақымданған жерге жиналып, бөлініп, зақымданған клетка орнын жаңа тінмен қаптайды. Аймақтық діңгекті жасушаларды зерттеу 40 жыл бұрын басталған. Олар тек зақымданған жерлерді қалыпқа келтіру үшін және тіндердің нақты бір түріне ғана қолданылады (бұлшық еттер, нерв, сүйек).

Сүйек миының діңгекті жасушалары әмбебап болады. Қанмен керекті мүше мен тінге түсе отырып, керекті клеткаға айналады. Олар ұрықтың тек ұрықтың дамуында маңызды роль атқарып қана қоймай, сонымен қатар нәресте және ересек организмде де сақталады.