Клубеньковые бактерии и их роль в азотистом обмене

 

Бактероиды содержат большее  количество волютиновых гранул и характеризуются более высоким содержанием гликогена и жира, чем палочковидные клетки. Бактероиды, выращенные в искусственных питательных средах и образовавшиеся в тканях клубенька, физиологически однотипны. Есть мнение, что бактероиды - это формы бактерий с незавершенным процессом деления. При незавершенном делении клеток клубеньковых бактерий возникают дихотомически ветвящиеся формы бактероидов. Количество бактероидов увеличивается при старении культуры; их появлению способствуют истощение питательной среды, накопление продуктов обмена, внесение в среду алкалоидов.

 

Рис. 3 - Бактероиды клубеньковых бактерий клевера. Слева видна клетка со жгутиком. Увел. X 16 000

 

В старых (двухмесячных) культурах  клубеньковых бактерий с помощью  электронного микроскопа можно выявить  во многих клетках четко очерченные образования сферической формы - артроспоры. Их количество в клетках варьирует от 1 до 5.

 

Рис. 4 - Образование (слева) и  выход (справа) артросиор из клеток клубеньковых бактерий клевера. Ультратонкие срезы. Увел. X 30 000

 

На питательных средах клубеньковые бактерии различных видов  бобовых растений растут с разной скоростью. К быстрорастущим относятся клубеньковые бактерии гороха, клевера, люцерны, кормовых бобов, вики, чечевицы, чины, донника, пажитника, фасоли, нута, лядвенца; к медленнорастущим - клубеньковые бактерии люпина, сои, арахиса, сераделлы, маша, вигны, эспарцета, дрока. Вполне сформировавшиеся колонии быстрорастущих культур можно получить на 3 - 4-е сутки инкубации, колонии медленнорастущих - на 7 - 8-е.

 

Для быстрорастущих клубеньковых бактерий характерно перитрихиальное расположение жгутиков, для медленнорастущих - монотрихиальное.

 

Кроме жгутиков, у клеток клубеньковых бактерий при выращивании  на жидких средах образуются нитевидные и четковидные выросты.Длина их достигает 8 -10 мкм. Они обычно располагаются на поверхности клетки перитрихиально, содержится их от 4 до 10 и больше на одну клетку.

 

Колонии быстрорастущих клубеньковых бактерий имеют цвет топленого молока, часто полупрозрачные, слизистые, с  ровными краями, умеренно выпуклые, со временем разрастаются на поверхности  агаризованной среды. Колонии медленнорастущих бактерий более выпуклые, мелкие, сухие, плотные и, как правило, не разрастающиеся на поверхности среды. Слизь, вырабатываемая клубеньковыми бактериями, представляет собой комплексное соединение полисахаридного типа, в состав которого входят гексозы, пентозы и уроновые кислоты.

 

Клубеньковые бактерии - микроаэрофилы (развиваются при незначительных количествах кислорода в среде), предпочитающие, однако, аэробные условия.

 

В качестве источника углерода в питательных средах клубеньковые бактерии используют углеводы и органические кислоты, в качестве источника азота - разнообразные минеральные и  органические азотсодержащие соединения. При культивировании на средах с  высоким содержанием азотсодержащих веществ клубеньковые бактерии могут утратить способность проникать в растение и образовывать клубеньки. Поэтому обычно клубеньковые бактерии выращивают на растительных экстрактах (фасолевом, гороховом отваре) или почвенных вытяжках. Необходимый для развития фосфор клубеньковые бактерии могут получать из минеральных и органических фосфорсодержащих соединений; источником кальция, калия и других минеральных элементов могут служить минеральные соединения.

 

Для подавления посторонней  сапрофитной микрофлоры при выделении  клубеньковых бактерий из клубеньков или непосредственно из почвы  рекомендуются питательные среды  с добавлением кристаллического фиолетового, танина или антибиотиков.

 

Для развития большинства  культур клубеньковых бактерий требуется  оптимальная температура в пределах 24-26°. При 0° и 37 °С рост приостанавливается. Обычно культуры клубеньковых бактерий в условиях лаборатории хранят при пониженных температурах (2-4 °С).

 

Многие виды клубеньковых бактерий способны синтезировать витамины группы В, а также ростовые вещества типа гетероауксина (бета-индолилуксусная кислота).

 

Все клубеньковые бактерии приблизительно одинаково устойчивы к щелочной реакции среды (рН = 8,0), но неодинаково  чувствительны к кислой.

 

Специфичность, вирулентность, конкурентоспособность и активность клубеньковых бактерий-понятие специфичности  клубеньковых бактерий - собирательное. Оно характеризует способность бактерий образовывать клубеньки у растений. Если говорить о клубеньковых бактериях вообще, то для них образование клубеньков только у группы бобовых растений уже само по себе специфично - они обладают избирательностью к бобовым растениям.

 

Однако если рассматривать  отдельные культуры клубеньковых бактерий, то оказывается, что среди них  есть такие, которые способны заражать лишь определенную, иногда большую, иногда меньшую, группу бобовых растений, и  в этом смысле специфичность клубеньковых бактерий - это избирательная способность  в отношении растения-хозяина. Специфичность  клубеньковых бактерий может быть узкой (клубеньковые бактерии клевера заражают только группу клеверов - видовая специфичность, а клубеньковые бактерии люпина могут  характеризоваться даже сортовой специфичностью - заражать только алкалоидные или  безалкалоидные сорта люпина). При  широкой специфичности клубеньковые бактерии гороха могут заражать растения гороха, чины, бобов, а клубеньковые бактерии чины и бобов могут заражать растения гороха, т. е. все они характеризуются  способностью «перекрестного заражения». Специфичность клубеньковых бактерий лежит в основе их классификации.

 

Специфичность клубеньковых бактерий возникла в результате их длительного приспособления к одному растению или к группе их и генетической передачи этого свойства. В связи  с этим различная приспособленность  клубеньковых бактерий к растениям  имеется и в пределах группы перекрестного  заражения. Так, клубеньковые бактерии люцерны могут образовать клубеньки  у донника. Но тем не менее они более приспособлены к люцерне, а бактерии донника - к доннику.

 

В процессе инфекции корневой системы бобовых растений клубеньковыми  бактериями большое значение имеет  вирулентность микроорганизмов. Если специфичностью определяется спектр действия бактерий, то вирулентность клубеньковых бактерий характеризует активность их действия в пределах данного спектра. Под вирулентностью подразумевается  способность клубеньковых бактерий проникать в ткань корня, размножаться там и вызывать образование клубеньков.

 

Большую роль играет не только сама способность проникать в  корни растения, но и скорость этого  проникновения.

 

Для определения вирулентности  штамма клубеньковых бактерий необходимо установить его способность вызывать образование клубеньков. Критерием  вирулентности любого штамма может  служить то минимальное количество бактерий, которое обеспечивает более  энергичное инфицирование корней по сравнению с другими штаммами, завершающееся формированием клубеньков.

 

Рис. 5 - Влияние разных по активности культур клубеньковых бактерий на развитие клевера. Справа - растение, зараженное неактивной культурой

 

В почве в присутствии  других штаммов не всегда более вирулентный штамм будет инфицировать растение первым. В этом случае следует учитывать его конкурентную способность, которая нередко маскирует свойство вирулентности в природных условиях.

 

Необходимо, чтобы вирулентные  штаммы обладали и конкурентоспособностью, т. е. могли успешно конкурировать  не только с представителями местной  сапрофитной микрофлоры, но и с  другими штаммами клубеньковых бактерий. Показателем конкурентоспособности  штамма служит количество образованных им клубеньков в процентах от общего числа клубеньков на корнях растений.

 

Важным свойством клубеньковых бактерий является их активность (эффективность), т.е. способность в симбиозе с  бобовыми растениями ассимилировать молекулярный азот и удовлетворять в нем  потребности растения-хозяина. В  зависимости от того, в какой степени  клубеньковые бактерии способствуют повышению  урожайности бобовых культур, их принято делить на активные (эффективные), малоактивные (малоэффективные) и неактивные (неэффективные).

 

Неактивный для одного растения-хозяина штамм бактерий в симбиозе с другим видом бобового растения может быть вполне эффективным. Поэтому при характеристике штамма с точки зрения его эффективности  следует всегда указывать, в отношении какого вида растения-хозяина проявляется его действие.

 

 Активность клубеньковых бактерий не является их постоянным свойством. Нередко в лабораторной практике наблюдается потеря активности у культур клубеньковых бактерий. При этом или теряется активность у всей культуры, или появляются отдельные клетки с малой активностью. Снижение степени активности клубеньковых бактерий происходит в присутствии некоторых антибиотиков, аминокислот. Одной из причин утраты активности клубеньковых бактерий может быть влияние фага. Пассированием, т. е. неоднократным проведением бактерий через растение-хозяина (адаптацией к определенному виду растения), можно получить эффективные штаммы из неэффективных.

 

Рис. 6 - Слой гранулированного вещества на поверхности корневого  волоска (1) при электронно-микроскопическом исследовании (по П. Дарту, Ф. Мерсеру, увел. X 30 000) и слизистый зооглейный слой (2), в который погружены корневые волоски клевера, под световым микроскопом (увел. X 80)

 

Воздействие гамма-лучами дает возможность получать штаммы с усиленной  эффективностью. Известны случаи возникновения  высокоактивных радиомутантов клубеньковых бактерий люцерны из неактивного штамма. Применение ионизирующих излучений, оказывающих непосредственное влияние на изменение генетических особенностей клетки, по всей вероятности, может явиться перспективным приемом при селекции высокоактивных штаммов клубеньковых бактерий.

 

Инфицирование бобового растения клубеньковыми бактериями-для обеспечения нормального процесса инфицирования корневой системы клубеньковыми бактериями необходимо наличие довольно большого количества жизнеспособных клеток бактерий в прикорневой зоне.

 

При развитии корневой системы бобового растения размножение клубеньковых бактерий на поверхности корня стимулируется  выделениями корня. Продукты разрушения корневых чехликов и волосков играют также немаловажную роль в обеспечении клубеньковых бактерий подходящим субстратом.

 

На поверхности корня  имеется слой слизистого вещества (матрица), образующийся независимо от наличия  в ризосфере бактерий. Этот слой хорошо виден при исследовании в  светооптическом микроскопе. Клубеньковые бактерии после инокуляции обычно устремляются к этому слою и скапливаются в  нем вследствие стимуля-ционного эффекта корня, проявляющегося даже на расстоянии до 30 мм.

 

О механизме проникновения  клубеньковых бактерий в корень растения существует ряд гипотез. Наиболее интересные из них следующие. Авторы одной из гипотез утверждают, что клубеньковые

бактерии проникают в  корень через повреждения эпидер-мальной и коровой ткани (особенно в местах ответвления боковых корней). Эта гипотеза была выдвинута на основании исследований Бриля (1888), вызвавшего образование клубеньков у бобовых растений путем прокалывания корней иглой, погруженной предварительно в суспензию клубеньковых бактерий. Как частный случай такой путь внедрения вполне реален. Например, у арахиса клубеньки преимущественно располагаются в пазухах ответвлений корней, что наводит на мысль о проникновении клубеньковых бактерий в корень через разрывы при прорастании боковых корней.

 

Интересна и не лишена оснований  гипотеза о проникновении клубеньковых бактерий в ткань kкорня через корневые волоски. Путь прохождения клубеньковых бактерий через корневые волоски признает большинство исследователей.

 

Не исключено, что клубеньковые бактерии могут проникать в корень через эпидермальные клетки молодых верхушек корня. По мнению Пражмовского (1889), бактерии могут проникать в корень только через молодую клеточную оболочку (корневых волосков или эпи-дермальных клеток) и совершенно не способны преодолевать химически измененный или оп-робковевший слой коры. Этим можно объяснить, что клубеньки обычно развиваются на молодых участках главного корня и появляющихся боковых корнях.

 

В последнее время большую популярность получила ауксинная гипотеза. Авторы этой гипотезы считают, что клубеньковые бактерии проникают в корень благодаря стимуляции синтеза р-индолилуксусной кислоты (гете-роауксина) из триптофана, имеющегося всегда в корневых выделениях растений. С наличием гетероауксина связывается искривление корневых волосков, которое обычно наблюдается при инфицировании корневой системы клубеньковыми бактериями.

 

Рис. 7 - Скопления клубеньковых бактерий вокруг корневых волосков. Стрелкой показано движение клеток клубеньковых бактерий к вершине корневого  волоска клевера

 

Источником бета-индолилуксусной кислоты в момент инфицирования растения, очевидно, служат не только растения, выделяющие через корневую систему триптофан, который многие виды бактерий, в том числе и клубеньковые, могут переводить в бета-индолилуксусную кислоту. Сами клубеньковые бактерии, а возможно, и другие виды почвенных микроорганизмов, живущие в зоне корня, также могут участвовать в синтезе гетероауксина.

 

Действие гетероауксина  неспецифично и вызывает искривление  корневых волосков у разных видов  растений, а не только бобовых. В  то же время клубеньковые бактерии вызывают искривление корневых волосков лишь у бобовых растений, проявляя при этом довольно значительную избирательность. Если бы рассматриваемый эффект определялся только (З-индолилуксусной кислотой, то такой специфики не было бы. Кроме того, характер изменений корневых волосков под влиянием клубеньковых бактерий несколько иной, чем под влиянием гетероауксина.