Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов

   Для получения  из хорионаллантоисной оболочки  материала, содержащего вирус,  её нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10-15 минут и надосадочная жидкость используется в качестве вируссодержащего материала.

                                   

                              Рис. 3. Заражение куриных эмбрионов

                            1.3.3. Заражение в аллантоиную полость

     Для заражения  берут эмбрионы 10-11-дневного возраста. Основные этапы заражения:

1. Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством.
2. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.
3. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение вируса. Иглу продвигают в вертикальном направлении на 2-3 мм ниже уровня воздушного мешка и затем вводят 0,1-0,2 мл материала.
4. Отверстие в скорлупе заделывают с помощью расплавленного стерильного парафина.

         Заражённые эмбрионы выдерживают  в термостате обычно в течение  2 суток. Перед вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 4⁰С. Вскрытие производится в следующем порядке:

1. Яйцо устанавливается на подставке так, чтобы воздушный мешок находился наверху, скорлупу над ним стерилизуют.
2. С помощью ножниц скорлупу срезают немного выше границы воздушного пространства.
3. Осторожно удаляют пинцетом скорлупную оболочку, после чего хорионаллантоисную оболочку прокалывают пастеровской пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную жидкость.
4. Аллантоисную жидкость переносят в стерильную пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на бактериологическую стерильность.

                                 1.3.4. Заражение в полость амниона

    Для заражения  используют эмбрионы 7-12-дневного  возраста. Заражение в амниотическую  полость проводят открытым или закрытым методом.

      Техника  открытого метода заражения:

1. Яйцо помещают на подставку и проводят стерилизацию скорлупы в области тупого конца.
2. Над центром воздушного пространства в скорлупе  ножницами вырезают окошко величиной  2 см в поперечнике.
3. Осторожно снимают внутренний листок скорлупной оболочки с помощью пинцета, обнажая подлежащую хорионаллантоисую оболочку.
4. Прорезают ножницами небольшое отверстие в хорионаллантоисной оболочке в том месте, где нет кровеносных сосудов, и вводят в прорез глазной пинцет. Пинцетом захватывают оболочку амниона и вытягивают амниотический мешок над поверхностью хорионаллантоисной оболочки.
5. Удерживая амниотическую оболочку в этом положении, производят заражение в полость амниона, вводя шприцем 0,1-0,2 мл разведения вируса.
6. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, пользуясь для фиксации и герметизации яйца расплавленным парафином.

        Заражённые эмбрионы инкубируют  в течение 2 суток, выбраковывая  погибшие в течение первых  суток. Затем эмбрионы выдерживают в течение ночи в холодильнике при 4⁰С.

     Техника  вскрытия эмбриона при заражении  в амниотическую полость:

1. Простерилизовав место предстоящего вскрытия, срезают скорлупу немного выше края воздушного мешка.
2. Прокалывают хорионаллантоисную оболочку пастеровской пипеткой и удаляют аллантоисную жидкость.
3. Захватив пинцетом амниотический мешок, прокалывают его оболочку иглой шприца или пастеровской пипеткой и насасывают амниотическую жидкость (от 0,5 до 1,5 мл). У заражённого эмбриона жидкость должна быть мутной, между тем как у нормального эмбриона она прозрачна.
4. Взятую жидкость переносят в стерильную пробирку. 0,1-0,3 мл засевают в бульон для контроля на бактериологическую стерильность.

1.4. Культивирование вирусов путём заражения лабораторных животных

          Восприимчивые к изучаемым вирусам  животные называются экспериментальной  моделью. Взятые в опыт животные  должны быть одного вида, определённого  возраста и содержаться в одинаковых  условиях.

                                                                                                              Таблица 2

                   Экспериментальные модели для некоторых вирусов

Наименование вируса	Экспериментальная модель
Вирус бешенства Вирус Коксаки Вирус полиомиелита Вирус гриппа Вирус клещевого энцефалита	Мыши, кролики Мыши-сосунки Обезьяны, крысы Мыши, хорьки Мыши

      Для вирусологической работы чаще всего используют так называемые «чистые линии» экспериментальных животных. Они обладают однотипной наследственностью, имеют минимальное число латентных инфекций, обладают высокой восприимчивостью к вирусам. Особенно чувствительны к вирусам животные-гнотобионты. Работу  животными рекомендуется проводить в настольном боксе или в специальной операционной вивария. Все отходы и трупы погибших животных автоклавируют и сжигают.

                                           

                                         Рис. 4. Лабораторное животное

              При вирусологических исследованиях  применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражение лабораторных животных.

                                        1.4.1. Интраназальное заражение  

          Метод используют для выделения пневмотропных вирусов. Заражение мышей проводится под эфирным наркозом. Животных помещают в закрытую стеклянную банку, в которую положен кусок ваты, пропитанный эфиром. С помощью шприца или пастеровской пипетки в ноздри животного вводят 0,03-0,1 мл заражающего материала. За животными устанавливается наблюдение, при проявлении признаков заболевания мышей забивают при помощи эфирного наркоза, а затем вскрывают.

                                  Этапы вскрытия животных:

1. Увлажнённый 5%-ным раствором лизола или фенола труп мыши фиксируют брюшком кверху на поверхности кюветы со смесью воска и парафина.
2. Обрабатывают кожные покровы спиртом, йодом и вновь спиртом; опаливают пламенем.
3. Ножницами делают продольный разрез кожи от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы к лапкам, отсепаровывают её.
4. Вскрывают грудную полость, вырезав грудину ножницами по рёберным хрящам.
5. Осматривают внешний вид органов грудной полости, обращая внимание на наличие экссудата. Извлекают лёгкие при строгом соблюдении асептики и сохраняют их при минусовой температуре в морозильнике до получения ответа на бактериологический контроль-результат посева кусочка легочной ткани в мясо-пептонный бульон (после выдерживания его в термостате при 37⁰С в течение суток). 
6. При отрицательном контроле на бактериальную загрязнённость готовят 10%-ную суспензию легочной ткани путём растирания ткани в фарфоровой ступке, с постепенным добавлением физиологического раствора.
7. Суспензию центрифугируют для осаждения крупных частиц при 1500 об/мин, надосадочную жидкость собирают и используют для последующего вирусологического исследования.

                              1.4.2. Интрацеребральное заражение

     Метод предназначен  для выделения нейротропных вирусов.  При заражении мыши в мозг  её плотно прижимают левой  рукой к столу, большим и  указательным пальцами оттягивают  кожу головы к затылку, мизинцем  и безымянным фиксируют хвост.  Лобный участок головы предварительно обрабатывают 3%-ной йодной настойкой.  Заражающий материал (кровь) в объёме 0,02-0,03 мл вводят в мозг туберкулиновым шприцем с тонкой иглой путём прокола лобной кости на глубину 1,5-2 мм.

                                           Этапы вскрытия животных:

1. Труп увлажняют раствором лизола или фенола.
2. Обрабатывают кожные покровы головы последовательно спиртом, йодом и вновь спиртом, опаливают пламенем.
3. Вскрывают и отделяют кожу головы. Отрезают голову, помещают её в стерильную чашку Петри, проведя предварительно через пламя горелки.
4. Вскрывают ножницами черепную коробку, извлекают мозг и сохраняют его в замороженном состоянии до получения результата бактериологического контроля.
5. В случае отрицательного бактериологического контроля из мозговой ткани приготавливают 10%-ную суспензию в физиологическом растворе. Освобождают её от крупных тканевых частиц центрифугированием, надосадочную жидкость используют для вирусологической работы.

      На лабораторных  животных проводят титрование  вирусов, ставят реакцию нейтрализации; животных используют для получения вирусных вакцин, диагностикумов, противовирусных сывороток.

 

 

                                           Контрольные вопросы

1. Назовите и охарактеризуйте методы электронной микроскопии, применяемые при изучении вирусов.
2. Применение светового микроскопа для обнаружения вирусов. Примеры.
3. Объясните, что понимают под тканевым (оранным) тропизмом вирусов.
4. Солевые растворы и питательные среды, используемые для культивирования культур клеток. Их состав. Примеры.
5. Назовите и охарактеризуйте основные типы культур клеток.
6. Первичные культуры клеток. Принципы приготовления этих культур.
7. Перевиваемые культуры клеток. Их характеристика.
8. Диплоидные культуры клеток. Их характеристика.
9. Применение культур клеток в вирусологии, их преимущества и недостатки.
10. Строение развивающегося куриного эмбриона (КЭ) и подготовка инкубированных КЭ к заражению. Способы заражения КЭ.
11. Преимущества и недостатки культивирования вирусов в КЭ.
12. Культивирование вирусов в организме восприимчивого животного. Способы заражения.
13. Применение экспериментальных животных в вирусологии, преимущества и недостатки.

                                             Тематика докладов

1. Преимущества выращивания вирусов в культуре клеток.
2. Особенности культивирования вирусов гриппа.
3. Основные методики изготовления вакцин против гриппа.
4. Трудности в создании вакцин против вируса иммунодефицита человека.

                                                     ЛИТЕРАТУРА

1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. 3-е изд. – М.: Медицина, 1982.
2. Букринская А.Г. Вирусология. – М.: Медицина, 1986.
3. Голубев Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. – Л., 1986. Электронный учебник.
4. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. – 4-е изд. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. Электронный учебник.  
5. Общая медицинская вирусология / Н.С. Горячкина и др.; под ред. Н.С. Горячкиной, Л.И. Кафарской. – Ростов н/Д: Феникс, 2007.
6. Общая микробиология: Лабораторный практикум. – Изд. 2-е, перераб., доп. – Нальчик: Каб.-Балк. ун-т, 2005.
7. www.medmaster.net
8. http://dronel.genebee.msu.su/journals/ microb-r.html

 

                    Раздел 2. Индикация и идентификация вирусов

 

1. Методы индикации и идентификации вирусов в клеточных культурах                                                                              

      При заражении вирусами клеточных культур можно получать различные видимые проявления действия вируса:

• Цитопатическое действие вируса на культуру клеток (ЦПД) – возникновение в ней видимых морфологических дегенеративных изменений (литическая инфекция);
• Приобретение заражённой культурой клеток способности к гемадсорбции – к адсорбции эритроцитов на поверхности клеточного слоя;
• Образование в заражённой клеточной культуре под плотным слоем специального агарового покрытия характерных бляшек, являющихся «негативными колониями» вирусов;
• Подавление процессов метаболизма в заражённой вирусом культуре клеток, выявляемое с помощью так называемой цветной пробы.