Полімеразна ланцюгова реакція. Мультикомплексна ПЛР

Міністерство освіти і науки, молоді та спорту України

Національний авіаційний університет

Інститут заочного та дистанційного навчання

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

КОНТРОЛЬНА РОБОТА

 

з дисципліни

«Генетика»

 

на тему: ” Полімеразна ланцюгова реакція. Мультикомплексна ПЛР. Ізоляція генетичного матеріалу. Ампліфікація та вимірювання кількості ДНК”

 

 

 

Виконала:

студентка 3 курсу ІЗДН

напрям підготовки 6.051401

Савенко Дар’я  Вікторівна

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Київ 2014

 

Зміст

 

1. Полімеразна ланцюгова реакція.
1. Принцип дії ПЛР.
2. Методи ПЛР.
2. Мультикомплексна ПЛР.
3. Ізоляція генетичного матеріалу.
4. Ампліфікація та вимірювання кількості ДНК.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Полімеразна ланцюгова реакція

 

     Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР або PCR) — експериментальний метод молекулярної біології, спосіб значного збільшення малих концентрацій бажаних фрагментів ДНК в біологічному матеріалі (пробі). Крім простого збільшення числа копій ДНК (цей процес називається ампліфікацією), ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з генетичним матеріалом (введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК), і широко використовується в біологічній і медичній практиці, наприклад для клонування генів, введення мутацій, виділення нових генів, секвенування, для створення і визначення генетично модіфікованих організмів, діагностики захворювань (спадкових, інфекційних), ідентифікації малих кількостей ДНК, встановлення батьківства.

     Полімеразна ланцюгова реакція була відкрита Кері Маллісом. Він був нагороджений Нобелівською премією з хімії1993 року за це відкриття, через сім років після того, як він і його колеги з корпорації Cetus запропонували його для практичного використання. Вперше метод був винайдений у 1983 році, під час роботи Малліса в компанії Cetus в містіЕмерівіль (Каліфорнія), одній з перших біотехнологічних компаній. Його задачею було створення коротких ланцюжків ДНК для інших учених. Малліс писав, що ідея ПЛР прийшла йому, коли він вночі в своєму автомобілі їхав уздовж Каліфорнійського шосе 1[1]. Він продумував новий шлях аналізу змін (мутацій) в ДНК, коли усвідомив, що замість цього він винайшов метод ампліфікації будь-якої ділянки ДНК за допомогою повторних циклів дублювання, які б здійснювавфермент ДНК-полімераза. В журналі Scientific American Малліс підвів подсумок методу: «Починаючи з єдиної молекули ДНК, носія генетичної інформації, ПЛР може надати 100 мільярдів подібних молекул за кілька годин. Реакцію дуже легко провести, вона вимагає однієї тестової трубки, незначної кількості реагентів, та джерела тепла» .

     Фермент ДНК-полімераза зустрічається природно в живих організмах. В живих клітинах він виконує функції реплікації ДНКпротягом мітозу та мейозу. Полімераза працює, зв'язуючись з одним ланцюжком ДНК та синтезуючи інший, створюючиподвійну спіраль. У першому прототипі процесу ПЛР, фермент використовувався in vitro (у контролюємому оточенні за межами організму). Дволанцюгова молекула ДНК розділялася на окремі ланцюжки за допомогою нагрівання до 94 °C. Однак при цій температурі ДНК-полімераза, що використовувалася на той час, денатурувалася, тому фермент доводилося додавати після стадії нагрівання на кожному циклі реакції. Оригінальна процедура була дуже неефективна, тому що вимагала багато часу, великих кількостей ДНК-полімерази, і безперервної уваги протягом всього процесу.

     Пізніше, цей оригінальний процес ПРЛ був значно вдосконалений використанням ДНК-полімерази, взятої з термофільних (теплолюбних) бактерій, що зазвичай ростуть в гейзерах за температури понад 110 °C. ДНК-полімераза, взята з цих організмів, стійка за високих температур, і при використанні у ПЛР не пошкоджується при нагріванні до необхідної температури. З тих пір, як необхідність додавати нову ДНК-полімеразу на кожному циклі зникла, процес копіювання ДНК був спрощений і автоматизований.

     Одна з перших теплостійких ДНК-полімераз була отримана від бактерії Thermus aquaticus і стала відома під назвою «Taq». Taq-полімераза широко використовується для ПЛР і зараз. Проте, її недоліком є те, що через відсутність механізму корекції помилок у 3'→5' напрямку, вона робить відносно велику кількість помилок при копіюванні ДНК, що приводить до мутацій. Нові полімерази, такі як Pwo або Pfu, отримані з архей, мають такий механізм корекції і можуть значно скоротити число мутацій, які зустрічаються в копійованій послідовності ДНК. Проте, ці ферменти полімеризують ДНК набагато повільніше, ніж Taq. Зараз доступні комбінації Taq і Pfu, що забезпечують як високу процесивність (протяжність ділянки, що синтезується за одне зв'язування ферменту, і в результаті швидкість синтезу), так і високу точність копіювання ДНК.

     ПЛР зараз може виконуватися на фрагментах ДНК розміром більше 10 kbp (тисяч пар основ), але середній розмір ділянки ДНК, що ампліфікується, — від кількох сотень до кількох тисяч пар основ ДНК. Проблема з довгими фрагментами — у великій кількості помилок та довгому часі реакції, тому необхідно підтримувати баланс між точністю і просесивністю фермента. Зазвичай, чим довше ділянка, тим вища ймовірність помилок.

     Метод ПЛР був запатентований корпорацією Cetus, де працював Малліс, невдовзі після його відкриття. Використання Taq-полімерази також було захищене патентами. Проте, відбулося кілька високопрофільних судових процесів щодо цього методу, зокрема невдалий судовий процес, ініційований компанієюDuPont. Фармацевтична компанія Hoffmann-La Roche придбала права на патенти в 1992 році і зараз має всі права на ПЛР. Битва патентів на право використання фермента Taq-полімерази все ще продовжується в кількох юрисдикціях у всьому світі між компаніями La Roche і Promega. Цікаво, що компаніям вдалося продовжити права на ПЛР і Taq на час після закінчення початкового патенту 28 березня 2005 року.

 

1. Принцип дії ПЛР

     Метод заснований на багатократному виборчому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів in vitro (в штучних умовах). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє задані умови, і лише в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку.

     За допомогою ПЛР зазвичай можуть бути ампліфіковані відносно короткі (до 10 kbp) ділянки ДНК з відомими кінцями, у окремих випадках можуть використовуватися ділянки до 40kbp. Для проведення найпростішої ПЛР потрібні такі компоненти:

• ДНК-матриця, тобто фрагмент ДНК, що містить ту ділянку, яку потрібно ампліфікувати.
• Два праймери, комплементарні кінцям необхідного фрагменту.
• Термостабільна ДНК-полімераза.
• Дезоксинуклеотидтрифосфати (A, G, C, T).
• Буферний розчин.

     ПЛР проводять в ампліфікаторі — приладі, що забезпечує періодичну та швидку зміну температури (охолоджування і нагрівання) тестових пробірок із розчином, зазвичай з точністю не менше за 0,1 °C.

     Специфічність ПЛР базується на утворенні комплементарних комплексів між матрицею і праймерами (короткими синтетичними олігонуклеотидами довжиною 18—30 основ). Кожен з праймерів комплементарний одному з ланцюгів дволанцюгової матриці, обрамляючи початок і кінець ділянки, яка ампліфікується.

     Після гібридизації матриці з праймером (відпал[5]), останній служить затравкою для ДНК-полімерази при синтезі комплементарного ланцюжка матриці (див. ниже).

     Найважливіша характеристика праймерів — температура плавлення (Tm) комплексу праймер-матриця. Вона визначається, як температура, за якої половина нуклеотидів праймера гібридизована із матрицею. Tm можна приблизно визначити за формулою  , де nX — кількість нуклеотідов Х в праймері. Якщо праймер короткий і Tm мала, то праймер може виявитися частково комплементарним до інших ділянок матричної ДНК, що може призвести до появи неспецифічних продуктів. Верхня межа температури плавлення — оптимум дії полімерази, активність якої зазвичай падає при температурі, вищіїй за 80 °C. Тому ретельний дизайн праймерів — необхідна задача, яку слід провести перед тимб як починати ПЛР.

     При виборі праймеров бажано дотримуватися наступних критеріїв:

• вміст GC ~ 40—60%;
• близькі Tm праймерів (відмінності не більш, ніж на 5 °C);
• відсутність неспецифічних вторинних структур — шпилек[6] і димерів[7];
• бажано, щоб на 3’-кінці був гуанін або цитозин.

     Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20—35 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій (див малюнок 2):

1. Дволанцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 94—96 °C (або до 98 °C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5—10 хв., щоб ланцюги ДНК розділилися. Ця стадія називається денатурацією — руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами. Іноді перед першим циклом проводять попереднє прогрівання реакційної суміші протягом 2—5 хв. для повної денатурації матриці і праймерів.
2. Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують, щоби праймери могли зв'язатися з одноланцюговою матрицею. Ця стадія називається відпалом (англ. annealing). Температура відпалу залежить від праймерів і зазвичай вибирається на 4—5°С нижче за їх температуру плавлення. Час стадії — 0,5—2 хв.
3. ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюжок, використовуючи праймер як затравку. Це так званастадія елонгації. Температура елонгації залежить від полімерази. Полімерази Taq і Pfu, що найчастіше використовуються, найактивніші за 72 °C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини фрагмента, який ампліфікують. Середня швидкість елонгації — 1000 пар основ за 1 хв. Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюжкові фрагменти. Ця стадія триває 10—15

1.2.Метод ПЛР.

• Вкладена ПЛР (англ. Nested PCR) — застосовується для зменшення частки побічних продуктів реакції. Використовують дві пари праймерів і проводять дві послідовні реакції. Друга пара праймерів ампліфікує ділянку ДНК усередині продукту першої реакції.
• Інвертована ПЛР (англ. Inverse PCR) — використовується в тому випадку, якщо відома лише невелика ділянка усередині потрібної послідовності. Цей метод особливо корисний, коли потрібно визначити фланкуючі послідовності після вставки ДНК в геном. Для здійснення інвертованої ПЛР проводять ряд розрізів ДНК рестриктазами з подальшим лігуванням. В результаті відомі фрагменти утворюються на обох кінцях невідомої ділянки, після чого можна проводити звичайну ПЛР.
• ПЛР із зворотною транскрипцією (або ЗТ-ПЛР, англ. Reverse Transcription PCR, RT-PCR) — використовується для ампліфікації, виділення або ідентифікації відомої послідовності з бібліотеки РНК. Перед звичайною ПЛР проводять транскрипцію молекули РНК за допомогою зворотнеї транскриптази і отримують комплементарну ДНК (кДНК). Цим методом часто визначають, де і коли експресуються певні гени.
• Асиметрична ПЛР (англ. Assymetric PCR) — проводиться тоді, коли потрібно ампліфікувати переважно один з ланцюжків початкової ДНК. Використовується в деяких методиках секвенування і гібридізаційного аналізу. ПЛР проводиться за класичним сценарієм, за винятком того, що один з праймерів береться у великому надлишку.
• Кількісна ПЛР (англ. Quantitative PCR, Q-PCR) — використовується для швидкого вимірювання кількості певної ДНК, кДНК або РНК у пробі. Цей метод зазвичай використовується «у реальному часі» (Кількісна ПЛР у реальному часі). При цьому застосовують флуоресцентно мічені реагенти для точного вимірювання кількості продукту реакції у міру його накопичення.
• Touchdown ПЛР (англ. Touchdown PCR) — за допомогою цього методу зменшують вплив неспецифічної гібридизації праймерів на утворення продукту. Перші цикли проводять при температурі, вищій за температуру відпалу, потім кожні декілька циклів температуру знижують. За певної температури система пройде через смугу оптимальної специфічності праймерів до ДНК.
• Метод молекулярних колоній (або «ПЛР в гелі», англ. Polony - PCR Colony) — поліакріламідний гель полімеризують зі всіма компонентами ПЛР на поверхні і проводять термоциклування. У точках, які містять ДНК, до якої підібрані праймери, відбувається ампліфікація з утворенням молекулярних колоній.
• Геліказно-залежна ампліфікація (англ. Helicase-dependent amplification) — подібна до звичайной ПЛР, але реакція проходить при постійній температурі. Для роз'єднання ланцюжків ДНК використовується геліказа замість теплової денатурації.
• ПЛР із швидкою ампліфікацією кінців кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE) — ампліфікація матричної РНК (мРНК) за допомогою відомого фрагмента усередині цієї молекули.
• ПЛР довгих фрагментів (англ. Long-range PCR) — модифікація ПЛР для ампліфікації протяжних ділянок ДНК (10 kbp і більше). Використовують дві полімерази, одна з яких — Taq-полімераза з високою процесивністю (тобто полімераза здатна за один прохід синтезувати довгий ланцюг ДНК), а друга — ДНК полімераза з 3'-5' ендонуклеазною активністю. Друга полімераза необхідна для того, щоб коригувати помилки, внесені першою.
• Випадкова ампліфікація поліморфної ДНК (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA, RAPD) — використовується тоді, коли потрібно розрізнити близькі за генетичною послідовністю організми, наприклад, різні сорти культурних рослин, породи собак або близькоспоріднені мікроорганізми. У цьому методі зазвичай використовують один праймер невеликого розміру (20 — 25 bp). Цей праймер буде частково комплементарний випадковим ділянкам ДНК досліджуваних організмів. Підбираючи умови (довжину праймера, його склад, температуру тощо), вдається добитися задовільної відмінності картини ПЛР для двох організмів.
• Мультиплексна ПЛР (англ. Multiplex PCR) — використання великого числа унікальних праймерів в одній реакції ПЛР для отримання кількох продуктів ПЛР різної довжини. Така реакція заміняє кілька окремих реакцій ПЛР, які вимагали би більшої кількості реагентів та часу. Температури відпалу кожного з наборів праймерів повинні бути оптимізовані, щоби вони могли правильно працювати в межах однієї реакції. Крім того, розміри ділянок ДНК, які ампліфікуються, повинні достатньо відрізнятися, щоб їх можна було розрізнити за допомогою гелевого електрофорезу.
• Мультиплексна ампліфікація проб за допомогою ліґування (англ. en:Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA) дозволяє ампліфікувати кілька ділянок ДНК за допомогою однієї пари праймерів.

     Якщо нуклеотидна послідовність матриці відома лише частково або невідома зовсім, можна використовувати вироджені праймери, послідовність яких містить вироджені позиції, в яких можуть розташовуватися будь-які нуклеотиди. Наприклад, послідовність праймера може бути такою: .ATH., де Н заміняє собою A, T або C.

 

2.Мультиплексна ПЛР.

  Мультиплекс ПЛР є широко  поширене молекулярної біології  для посилення кількох цілей  в одному експерименті ПЛР. У  мультиплексування аналізі більше  одного послідовність -мішень може  бути посилений за допомогою декількох пар праймерів в реакційній суміші. Як розширення практичного використання ПЛР , цей метод має потенціал для виробництва значну економію часу і зусиль в лабораторії без шкоди для корисності експерименту .

 

 

 

Види Мультиплекс ПЛР

Мультиплексування реакції можна розділити на дві категорії:

1 . Одномісний ПЛР Шаблон Реакція

Цей метод використовує один шаблон , який може бути геномної ДНК разом з кількома парами прямого і зворотного праймерів для ампліфікації специфічних областей в шаблоні.

2 . Кілька ПЛР Шаблон Реакція

Він використовує кілька шаблонів і кілька наборів праймерів в одній реакційної трубі. Наявність декількох праймерів може привести до крос - гібридизації один з одним , а також можливість неправильної заливки з іншими шаблонами

 

 

 

 

     Проектування конкретних наборів праймерів має важливе значення для успішного реакції мультиплексу . Важливими міркувань дизайну праймерів , описані нижче, є ключем до специфічної ампліфікації з високим виходом.

1 . Проектування довжини

Multiplex PCR аналізи включають проектування  великого числа праймерів , отже, необхідно , щоб призначений грунту  повинна бути відповідної довжини . Зазвичай праймери короткої довжини , в діапазоні 18-22 підстав використовуються

2 . Температура плавлення

     Грунтовки з аналогічним Tm , переважно від 55 ° C - 60 ° C використовуються. Для послідовностей з високим вмістом GC , грунтовок з більш високою Tm (переважно 75 ° C - 80 ° C) рекомендується. Варіант Tm між 3 ° -5 ° С є прийнятним для праймерів , що використовуються в басейні.

3 . Специфічність

Важливо враховувати специфічність розроблених праймерів до послідовностей - мішеней , при підготовці тесту мультиплексной , тим більше , що конкуренція існує , коли декілька послідовностей - мішеней в одному реакційному посудині.

4 . Уникайте Primer димарів

Розроблені праймери повинні бути перевірені для формування праймерів димарів , з усіма праймерів , присутніх в реакційній суміші. Димеризация призводить до неспецифічної ампліфікації .

 

 

 

3.Ізоляція генетичного  матеріалу.