Полімеразна ланцюгова реакція. Мультикомплексна ПЛР

     Велика частина ефективності ПЛР знаходиться в його здатності легко ізолювати специфічні регіони послідовності ДНК з маретіалу цілого генома. Для багатьох методів потрібний резервуар молекул ДНК, ізольованих із специфічного фрагмента ДНК, і використання ПЛР зробило всі ці методи більш ефективними. Оскільки ПЛР також ампліфікує ізольований регіон, методи потребує дуже маленьких кількостей матеріалу для аналізу.

4.Ампліфікація та вимірювання кількості ДНК.

     Ампліфікація - лат. amplificatio - збільшення , поширення.

     Ампліфікація ДНК - це будь-який процес , що збільшує число копій якого гена або послідовності ДНК набагато вище звичайного для організму рівня.е

     Одним з найбільш продуктивних способів ампліфікації є реплікація за способом котиться кільця ( Bostock , 1986 ), яка використовується в ооцитах амфібій. У цьому випадку формується екстрахромосомальная кільцева ДНК , що виробляє безліч послідовностей , що містять тандемні повтори вихідної копії .      Ще одним способом ампліфікації є прослизає реплікація , коли ДНК -полімераза в ході процесу реплікації повертається назад і використовує вже реплицироваться ділянку , виробляючи , таким чином , велика кількість тандемно - повторених копій.

     Для здійснення наступного етапу ДНК - діагностики - ампліфікації ДНК - лікарі використовують так звані ДНК - матриці - молекули ДНК інфекцій , на які згодом відбуватиметься « клонування » ДНК. Вже згадувалося , що наявність повної ДНК інфекції необов'язково , для проведення цього етапу досить невеликого шматочка молекули ДНК , який притаманний лише даному мікробу ( інфекції).

     В основі ампліфікації ДНК і відповідно в основі всього принципу ПЛР - реакції лежить природний для всього живого процес добудовування ДНК - реплікації ДНК , який здійснюється шляхом подвоєння одиничної ланцюжка ДНК.

     Почавши з одного -єдиного фрагмента ДНК , лікар- лаборант копіює його і збільшує кількість копій в режимі ланцюгової реакції: після першого циклу у вас вже є 2 фрагмента , після другого циклу - 4 , після третього - 8 , після четвертого - 16 , потім 32 , 64 , 128 , 256 ... З кожним циклом відбувається подвоєння числа копій , і після двадцяти циклів рахунок вже йде на мільйони , а після тридцяти - на мільярди . Цикл триває лічені хвилини і зводиться до певної зміни температурного режиму в дуже невеликій хімічному реакторі. Тут в розчині в достатній кількості знаходяться всі потрібні компоненти синтезу , насамперед , нуклеотиди А , Г , Т і Ц , а також проведені тонкі підготовчі хімічні операції для того , щоб з кожного готового відрізка ДНК тут же знімалася точна копія , потім з цієї копії - знову копія , в цьому і полягає розгалужена ланцюгова реакція.

     Шляхом приєднання до ланцюга ДНК праймерів - штучно синтезованих « шматочків » ДНК ( нуклеотидних пар ) , аналогічних ДНК мікробів (інфекції ) - утворюються дві короткі , що складаються з двох ланцюгів ділянок ДНК , спіралі , необхідні для синтезу майбутньої ДНК.

     Синтез нового ланцюга відбувається шляхом добудовування кожної з двох ниток ДНК. Процес ампліфікації відбувається за допомогою специфічної ділянки - ДНК -полімерази , який дав назву лабораторному методу. Полімераза виступає в ролі каталізатора реакції і стежить за послідовним прикріпленням нуклеотидних підстав до зростаючої нового ланцюга ДНК.

     Таким чином , ампліфікація ДНК являє собою багаторазове збільшення числа копій ДНК , які специфічні , тобто притаманні лише певному організму . Немає необхідності добудовувати весь ланцюг ДНК , щоб побачити збудника інфекції.   Потрібен тільки ту ділянку , який характерний для даної бактерії як для індивідуальності.

     Всі численно повторювані етапи ампліфікації відбуваються при різних температурах. Для проведення ПЛР - аналізу використовується спеціально програмований обладнання - ПЛР - термостат або ампліфікатор , яке автоматично здійснює зміну температур. Ампліфікація проводиться за заданою програмою , що відповідає виду обумовленою інфекції. Залежно від програми і виду обумовленою інфекції процес автоматизованої ПЛР займає від 2 до 3 годин.

Список використаної літератури

 
1. Глік Б., Пастренак Дж. Молекулярна біотехнологія. Принципи та застосування - Москва: Мир, 2002.  
 
2. Сінгер М., Берг П. Гени і геноми - Москва: Мир, 1998.  
 
3. Щелкунов С. Н. Генетична інженерія - Новосибірськ: Сиб. унів. изд-во, 2004  
 
4. У світі Науки (Scientific American). Червень № 6 1990 г  
 
5. Трофімова Т. І. Курс фізики. Москва: Вища школа, 2002  
 
6. Стільбанс Л. С. Фізика напівпровідників. Москва, 1967.