Правила работы в бактериологическом отделе

                                                                 Введение

 

Бактериологический отдел  предназначен осуществлять санитарно-микробиологический контроль сырья, вспомогательных продуктов, готовой продукции, санитарно-гигиенического состояния производственных помещений, технологического оборудования, инвентаря, тары, рук, санитарной одежды работающих.

 В своей деятельности  он руководствуется действующими  нормативными документами. 

Содержит подготовительное отделение, средоварку, термостатное и  автоклавное отделения, моечную.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 Правила работы в бактериологическом отделе

 

К работе в отделе допускаются  лица, сдавшие экзамены по режиму работы и технике безопасности.

Лица, принятые на работу должны знать правила обращения с  культурами микроорганизмов и материалом, зараженным или подозреваемым в  заражении патогенными микроорганизмами, порядок эксплуатации лабораторного  оборудования и работы с кислотами  и щелочами.

Вход посторонних лиц  в микробиологическую лабораторию  воспрещается.

У входа в лабораторию  помещен дезинфекционный коврик для санитарной обработки обуви. Сотрудники при входе в лабораторию  должны снять верхнюю одежду и  обувь в отведенном для этого  месте и надеть санитарную одежду и сменную обувь. В рабочие  помещения лаборатории запрещается  проносить продукты питания, принимать  пищу в них и курить.

Перед каждым лабораторным исследованием и после него каждый работник обязан тщательно вымыть руки с мылом, продезинфицировать их и  вновь вымыть. Для дезинфекции  рук применяют 0,5-1 %-ный раствор  хлорамина.

Микробиологические исследования поступающего сырья и вспомогательных  материалов осуществляются выборочно  в соответствии с действующими нормативными документами.

 

 

 

 

 

 

 

 

2 Подготовка к  исследованию

Приготовление питательных  сред, реактивов, красок Приготовление мясо-пептонного агара.

К 1000 мл мясо-пептонного бульона  перед стерилизацией добавляют 20г  агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного  растворения.

Мясо-пептонный агар, охлажденный  до температуры 50 -55°С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 мл мясо-пептонного агара), помещают в автоклав, не завинчивают крышку автоклава, или в аппарат Коха на 1 ч, чтобы белок свернулся и, оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горячий мясо-пептонный  агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают в нем рН 7,0 - 7,4, разливают во флаконы или  пробирки и 20 мин стерилизуют в  автоклаве при температуре 120°С.

 

Приготовление среды  Левина

К 100 мл расплавленного мясо-пептонного агара с рН 7,0 - 7,4 добавляют 2 мл 0,5%-ного водного раствора предварительно подогретой на водяной бане метиленовой сини, 1,5 мл 2%-ного раствора эозина (бактериологического), 2 г лактозы и 0,2 г двузамещенного фосфорного калия. Растворы красок готовят на дистиллированной воде и стерилизуют 1 ч при температуре 100°С. После добавления всех компонентов в указанном порядке среду тщательно перемешивают, разливают в чашки и подсушивают. Среда должна иметь красно-фиолетовый цвет.

 

Приготовление среды  Китт - Тароцци

Свежую печень крупного рогатого скота разрезают на куски массой по 50 - 60 г, заливают равным количеством воды и кипятят в течение 30 мин при постоянном помешивании. Печеночный экстракт фильтруют через ватно-марлевый фильтр и смешивают с мясо-пептонным бульоном из расчета одна часть печеночного экстракта на три части бульона. Смесь нагревают до кипения, добавляют хлористый натрий из расчета 1,25 г на 1000 мл среды и устанавливают рН 7,6 - 7,8, после чего кипятят в течение 15 мин и фильтруют через бумажный фильтр.

В пробирки кладут мелко  нарезанные кусочки печени по 1,5 - 2 г и заливают смесью печеночного экстракта с мясо-пептонным бульоном. На поверхность среды наслаивают 0,5 - 1 мл вазелинового масла. Среду стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120°С.

 

Приготовление бульона  Хоттингера и среды, его содержащей

Для приготовления основного  раствора Хоттингера в 1 дмЗ кипящей  воды на 20 мин опускают 1 кг мяса, нарезанного маленькими кусочками, затем мясо вынимают, измельчают на мясорубке и снова кладут в тот же отвар. Добавляют 30-40 г измельченной поджелудочной железы (или 3-5 г панкреатина) и 20 смЗ хлороформа. Бутылки плотно закрывают пробкой и энергично встряхивают, ставят в термостат при температуре 37°С на 3-4 часа. Мясо в виде мелкозернистой массы осаждается на дно бутылки. Жидкость над мясом должна быть прозрачной. Жидкость сливают, фильтруют и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 20 мин. Готовый раствор должен давать положительную реакцию на триптофан (розовое окрашивание при прибавлении 2 капель бромной воды в пробирку с пробой/

 

Для приготовления  бульона Хоттингера смешивают 200 см^З основного раствора Хоттингера, 400 см^З мясного отвара и 400 см^З, добавляют 5 г хлористого натрия, 0,2 г фосфорнокислого двузамещенного натрия, кипятят 10 мин и устанавливают рН (7,6±0,1). Бульон Хоттингера разливают высоким столбиком по пробиркам или флаконам, на дно которых кладут кусочки вареного мяса или фарша, наслаивают стерильное вазелиновое масло высотой около 2,0 см и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 20 мин.

Для приготовления  плотной среды Хоттингера с триптоном, глюкозой и дрожжевым экстрактом в 1 дм^З бульона Хоттингера вносят 0,5 г дрожжевого экстракта или 2,5 см^З раствора дрожжевого экстракта, 5 г глюкозы, 5 г триптона, 15-20 г агара, устанавливают рН среды (7,1+0,1) и стерилизуют ее при температуре (121±1)°С в течение 20 мин. Перед употреблением в расплавленную стерильную среду асептически вносят 0,6 г аскорбиновой кислоты.

Приготовление среды  Крумведе-Олькеницкого в модификации  Ко-валъчука

В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют I г гипосульфита, 0,6 г соли Мора, 10 г мочевины, 15 г лактозы х.ч., 3,5 г сахарозы и 2 г глюкозы. Устанавливают рН среды до 7,4 - 7,6. Добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором ВР. Все размешивают, кипятят в водяной бане в течение 40 мин. Разливают в пробирки по 5 - 6 см³. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют 20 мин при давлении 5104 Па. После стерилизации среду скашивают так, чтобы в пробирке остался столбик высотой не менее 3 см.

 

Приготовление среды  ХБ (хинозол-бромкрезол-пурпурной)

Для приготовления бромкрезол-пурпура  0,8 г порошка заливают 50 см³ этилового ректификованного спирта. Через день раствор готов к употреблению.

Для приготовления хинозола 0,1 г порошка растворяют в 100 см³ стерильной дистиллированной воды

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 Проведение анализа

 

Глубинный метод  посева в плотные среды

Жидкий продукт или  разведение навески вносят параллельно  в две чашки Петри и заливают не позднее чем через 15 мин расплавленной  и охлажденной до температуры (45±1)°С питательной средой. Высота слоя питательной  среды должна быть 4--5 мм.

Среду немедленно равномерно перемешивают с посевным материалом круговыми движениями чашки так, чтобы среда не вытекла из чашки  н не загрязняла крышку. После застывания среды чашки с посевами вверх  дном помещают в термостат.

 

Поверхностный метод  посева на плотные среды

Среду налипают в чашку  Петри и после застывания подсушивают. При подсушивании для удаления влаги  с поверхности среды чашки  открывают, переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 30 мин  при 48--50°С или в ламинарном боксе 1--2 ч. или в других условиях, обеспечивающих испарение конденсационной влаги  и исключающих микробное загрязнение.

На подсушенную среду  наносят жидкий продукт или разведение навески и немедленно равномерно растирают по поверхности шпателем -- изогнутой стеклянной палочкой.

Засеянную поверхность подсушивают, выдерживая чашки в горизонтальном положении в течение 15 мин.

 

Метод посева в  жидкие среды

В колбу или пробирки с  питательной средой вносят навеску  продукта или разведеные навески.

При определении наиболее вероятного числа (НВЧ) микроорганизмов  из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений до такой степени, чтобы можно было определить предполагаемое НВЧ микроорганизмов.

Самое низкое разведение и  высеваемые объемы его инокулума  выбирают в зависимости от предполагаемого  количества микроорганизмов н чувствительности метода следующим образом:

По 1 см^З из разведения 10-1 и высших разведений, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 1,0 г продукта;

по 10 см^З из разведения 10-1 или 1 см^З неразведенного продукта и по 1 см^З из разведения 10-1 и более высокого разведения, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 10,0 г продукта;

по 10 и 1 см^З неразведенного продукта и ряда его разведений, если надо определить количество микроорганизмов, превыщающее 3 клетки в 100 см^З продукта.

Все разведения и неразведенный  продукт высевают параллельно в  три пробирки с питательной средой. Инокулум объемом 1 см^З высевают в 10 см^З среды нормальной концентрации, инокулумы объемом 10 см^З в 10 см^З среды двойной концентрации.

Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

В стерильную колбу помещают 50 г корма, взятого из среднего образца (взятие корма для навески одноразовое), добавляют 450 мл физиологического раствора (получают разведение 1:10), тщательно  встряхивают. Из полученной взвеси готовят  последовательные десятикратные разведения (1:100, 1:1000, 1:10000 и т.д.). После оседания взвешенных частиц из верхнего слоя жидкости делают посевы

Для количественного учета  микробного обсеменения в стерильные бактериологические чашки вносят по 1 мл каждого разведения и заливают 10-15 мл стерильного, расплавленного и  охлажденного до температуры 44-45°С мясопептонного агара. Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре. После застывания среды  чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 30°С. После 72 часового, термостатирования проводят, подсчет выросших колоний только в чашках, где содержатся не более 300 и не менее 3 колоний. Результаты, полученные при подсчете колоний, умножают на разведения, вычисляют среднее арифметическое. Полученная цифра принимается за общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г корма.

 

Исследования  на сальмонеллы

Метод последовательного обогащения

Навеску исследуемого материала 25г помещают в колбу, содержащую 225 мл забуференной пептонной воды (среда  предварительного обогащения).

Содержимое колбы тщательно  перемешивают и помещают в термостат  при температуре 37°. Через 6-18 часов  производят пересев на основные среды  обогащения (селенитовый бульон, магниевую  среду или другую аналогичную  среду по выбору) в соотношении 1:5.

После 16 - 18 час. инкубирования  в термостате при 37° из обогатительных сред бактериологической петлей производят посевы на бактериологические чашки  с твердыми дифференциально-диагностическими средами (висмут-сульфитный агар, среда  Эндо или другие аналогичные среды  по выбору), которые помещают в термостат  при 37°.

Засеянные чашки просматривают  через 24 - 48 часов.

На висмут-сульфит агаре S. typhi, S paratyphi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний  с черным центром; S. cholerae suis - в виде зеленых колоний. Колонии почти  всех других сальмонелл значительно  крупнее, темно-коричневого цвета  с ртутным блеском, окруженные светлым  ореолом, участок среды под колонией прокрашен в темно-коричневый цвет.

В случае обнаружения колоний, подозрительных на сальмонеллы, 3-5 из них  засевают на МПА (для постановки РА), на бульон Хоттингера (для определения  индола и сероводорода), в полужидкий (0,3 - 0,5%) агар (посев уколом для определения  подвижности) и трехсахарный агар с  мочевиной Крумвиде - Олькеницкого (сначала штрихом на скошенной поверхности, а затем уколом и глубину столбика). Посевы выдерживают в термостате при температуре 37° 16-18 часов. При росте бактерий из рода Salmonella цвет скошенной поверхности среды Крумвиде - Олькеницкого -розовый, столбик - желто-бурый, газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, при наличии сероводорода столбик чернеет.

При разложении лактозы косая  поверхность окрашивается в желтый цвет. При разложении одной глюкозы  окрашивается только столбик среды  и происходит разрыв агара со скоплением в нем пузырьков газа. При разложении мочевины на "скошенном столбике" окраска среды меняется на малиновую.

Культуры, представляющие грамотрицательные, подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, подвергаются серологическому  исследованию в реакции агглютинации на предметном стекле с набором агглютинирующих  сывороток в соответствии с Наставлением к набору. Для реакции агглютинации используют суточные культуры, выращенные на МПА. При этом для реакции агглютинации с О - сыворотками культуру следует  брать из верхней части скошенного агара, а для агглютинации с Н - сыворотками - из самой нижней части (конденсационной воды), где микробы  наиболее подвижны.