Принцип роботи iнтерференцiйного мiкроскопу

 

 

ЗМIСТ

 

ВСТУП

 

Iнтерференцiйна мiкроскопiя - мікроскопія, що дає можливість спостерігати незабарвлені прозорі структури, а також обчислити їх суху масу. Здійснюється за допомогою інтерференційного мікроскопа, в якому ділянки об'єкта, що мають різну товщину або неоднакові показники заломлення, внаслідок інтерференції світла утворюють світловий ефект різнобарвності і тому мають контрастний вигляд.

Початок інтерференційної мікроскопії було покладено в 1893 роцi англ. вченим Дж. Сірксом. Її суть полягає в тому, що кожен промінь, входячи в мікроскоп, роздвоюється. Один з отриманих променів прямує на спостережувану частку, iнший - повз неї. В окулярнiй частинi обидва променi знову з'єднуються, і між ними виникає інтерференція.  
1. Принцип роботи iнтерференцiйного мiкроскопу

 

Інтерференція світла - перерозподіл інтенсивності світла в результаті накладання (суперпозиції) декількох когерентних світлових хвиль. Це явище супроводжується максимумами і мінімумами інтенсивності, якi чергуються в просторі. Її розподіл називається інтерференційною картиною.

Отримати стійку інтерференційну картину для світла від двох розділених у просторі і незалежних один від одного джерел світла не так легко, як для джерел хвиль на воді. Так, інтерференція виникає при поділі початкового променя світла на два промені при його проходженні через тонку плівку, наприклад плівку, яку наносять на поверхню лінз у просвітлених об'єктивів. Промінь світла, проходячи через плівку товщиною d, відіб'ється двічі - від внутрішньої і зовнішньої її поверхонь. Відбиті промені матимуть постійну різницю фаз, рівну подвоєнню товщини плівки, через що промені стають когерентними і будуть iнтерферувати.

Явище інтерференції спостерігається в тонкому шарі несмешивающихся рідин (гасу або масла на поверхні води), в мильних бульбашках, бензині, на крилах метеликів, в кольорах мінливості, і т. д.

Інтерференція в тонкій плівці. Альфа - кут падіння, бета - кут заломлення, жовтий промінь відстане від оранжевого, вони зводяться оком в один і інтерферують.

 

2. Iнтерференцiйнi вимiрювання

 

 

Інтерференційні методи вимірювань інтегральних і локальних параметрів фазових мікрооб'єктів

Фазові мікрооб'єкти, прозорі для випромінювання видимого оптичного діапазону, широко поширені як в промисловості, так і в біології та медицині. До них відносяться різні полімерні плівки, кристали, оптичні мікродеталі, оптоволоконні вироби і, нарешті, біологічні мікрооб'єкти - клітини та ін. Ці об'єкти описуються тривимірним (3D) просторовим розподілом показника заломлення, з яким пов'язані щільність, температура, концентрація та інші фізичні параметри об'єкта [1].

При вивченні фазових об'єктів відразу виникає задача їх візуалізації. На сьогоднішній день вона вирішена. Широко відомі наступні методи: фазовий контраст (метод Цернике), інтерференційний контраст, диференційно-інтерференційний контраст (метод Номарського, DIC), метод темного поля, поляризаційний контраст і пр. [2]. Проте в даний час при дослідженні фазових мікрооб'єктів потрібно не тільки спостерігати і оцінювати різні геометричні параметри (площа, периметр), але і проводити вимірювання їх локальних і інтегральних характеристик.

Вихідним вимірюваним параметром фазового об'єкта є оптична різниця ходу (ОРХ). Це інтегральна характеристика, так як ОРХ являє собою інтеграл від функції розподілу показника заломлення вздовж променя або одновимірну (1D) промінь-суму. Двовимірне (2D) розподіл ОРХ, отримане вздовж набору паралельних променів, є паралельною 2D - проекцією, а вздовж набору променів, що перетинаються в одній точці - конічної 2D - проекцією. Будемо далі називати 2D розподіл ОРХ фазовим зображенням. По набору значень ОРХ, виміряних при різних кутах зондування, можна реконструювати 3D - просторовий розподіл показника заломлення п (х, у, г) - локальний по простору параметр фазового об'єкта. З ОРХ і 3D - розподілу п (х, у, г) можуть бути обчислені різні похідні характеристики, від цих величин:

- щільність [1];

- концентрація [1];

- морфометричнi характеристики, наприклад обсяг, середній радіус, площа клітини і т. п. [3];

- маса сухих речовин біологічної клітини [4] (в [5] показано зв'язок між оптичною різницею ходу світла, що пройшло через клітку, і масою її сухої речовини, а в [6, 7] - можливість її вимірювання за допомогою інтерференційного мікроскопа);

- величина двопроменепереломления (ДПП) (традиційно вимірюваний поляризаційними методами, показник ДПП може бути виміряний інтерференцiонно-поляризаційним методом, який якісно відрізняється від аналогічних поляризаційних методів відсутністю необхідності вимірювання товщини досліджуваного об'єкта [8]).

Показник заломлення пов'язаний з поляризованiстю білкових структур клітини, отже, фазове зображення несе цінну діагностичну інформацію про стан біологічного мікрооб'єкту. Тому за допомогою інтерференційного мікроскопа можна вести моніторинг стану як окремої клітини [9], так і цілої популяції клітин [10]. Це може бути використано, наприклад, для діагностики стану системи крові [10].

Кореляція між різними процесами, що відбуваються в живій клітині, і величиною ОРХ дозволяє використовувати фазовi зображення також для дослідження цих динамічних процесів [11].

Кількісні дослідження характеристик фазових мікрооб'єктів можна проводити тільки за допомогою інтерференційних мікроскопів [12]. Тільки вони дозволяють вимірювати ОРХ. Інші способи дозволяють лише візуалізувати, або вимірювати похідну по напряму від ОРХ (DIC). Однак, широкому поширенню інтерференційних мікроскопів перешкоджала відсутність автоматизованих методів розшифровки інтерферограмма, що гальмувало впровадження даних мікроскопів в практику лабораторних досліджень і рутинних вимірювань.

 

3. Iнтерференцiйнi мiкроскопи

 

Види iнтерференцiйних мiкроскопiв

Для проведення вимірювань в основному використовують мікроскопи, в основі яких лежать різні схеми двупроменевих iнтерферометрiв Майкельсона, Маха-Цендера і Миро [12]:

- схема розподілу пучків Майкельсона використовується в мікроінтерферометр академіка В.П. Линника (1933). Мікроскоп Линника дозволяє працювати з мікрооб'ектіва великих числових апертур. Для дослідження фазових мікрооб'єктів, вони повинні розміщуватися на дзеркалі, розташованому в предметному каналі. В цьому випадку випромінювання двічі проходить крізь них (схема на віддзеркалення) [12].

- схема розподілу пучків Маха-Цендера використовується в мікроскопі Хорна (Horn, 1950). У своєму складі він має дві ідентичні гілки, в яких розташовуються досліджуваний препарат і препарат порівняння. Випромінювання проходить через досліджуваний мікрооб'єкт один раз (схема на просвіт) [12].

- схема розподілу пучків по Миро використовується в мікроскопі Дайсона (Dyson, 1950; Pfeiffer, 1954). Пучок порівняння і предметний пучок формуються шляхом ділення по амплітуді вихідного пучка. Недоліком цієї схеми є значна втрата світла і розсіяне світло, що виникають внаслідок багатьох відображень. Дана схема також призначена для дослідження фазових мікрооб'єктів на просвіт [12].

Однією з тенденцій сучасної інтерференційної мікроскопії є створення самостійних оптичних вузлів з мікрооб'єктива, якi реалізують той чи інший вид інтерференційної схеми (мікрооб'єктив-iнтерферометр). Відомі такі схеми, реалізовані для iнтерферометрiв Фiзо, Миро, Майкельсона і Линника.

Традиційно розшифровка інтерферограм, отриманих на таких мікроскопах, проводилася вручну. Тільки в останні десятиліття були запропоновані й освоєні алгоритми автоматичної розшифровки інтерферограмма, які згодом були застосовані і в інтерференційних мікроскопах. Цьому сприяло появою швидких ЕОМ, систем захоплення і обробки зображень, високо чутливих ПЗС-камер.

Вперше автоматизований варіант интерференционного мікроскопа Линника МII-4 був розроблений професором В.П. ТичинськиМ (1989) і названий "Ейріскан" [13]. В якості фотоприймального пристрої в цьому мікроскопі використовується диссектор. Зображення об'єкта виходить шляхом розгортки. Для реконструкції фази реалізований компенсаційний метод (метод тимчасових інтервалів). Значення фази в обраній точці пропорційно нормованному тимчасовому інтервалу між моментами реєстрації двох мінімальних значень інтенсивності на фотоприймачi при зсуві дзеркала опорного каналу на половину довжини хвилі випромінювання. Час знімання даних прямо пропорційно залежить від числа відліків, в яких проводяться вимірювання і становить 1мс/піксель. Тобто за час одного телевізійного кадру (40мс) реєструється зображення розміром 40 пікселів.

Відомий також автоматизований варіант мікроскопа Хорна (Zicha і Данн, 1995) [5]. В цьому мікроскопі використовується метод фазових кроків [14]. Дискретний фазовий зсув забезпечується поперечним переміщенням компенсаційного клина, керованого від крокової двигуна. Даний метод отримав назву DRIMAPS (цифровий запис втручання мікроскопії з автоматичним зсувом фази - цифрова интерференционная мікроскопія з автоматичним фазовим зрушенням). Схема мікроскопа Хорна складна в експлуатації та налаштування, так як вимагає наявності двох ідентичних каналів з однаково приготованими препаратами: досліджуваного препарату та препарату порівняння.

Серед усіх схем найбільш краща схема інтерферометра Линника. Її переваги в тому, що вона дозволяє забезпечити:

- високу просторову роздільну здатність, внаслідок можливості використання мікрооб'ектіва великий числової апертури;

- підвищену чутливість у вимірі ОРХ через подвійне проходження світла (схема на віддзеркалення).

Вiтчизняними фахівцями розроблений автоматизований інтерференційний мікроскоп на базі мікроінтерферометр Линника МII-4 (М). МII-4 (М) серійно випускається підприємством ЛОМО і призначений для візуальної оцінки і вимірювання параметрів шорсткостей що відбивають світло. Принцип і схема мікроінтерферометр МИИ-4 вперше були розроблені і застосовані для дослідження якості тонкообработанних поверхонь академіком В. П. Линником.

Важливою перевагою цього інтерферометра є можливість роботи з широким джерелом просторово-некогерентного монохроматичного випромінювання.

Це властивість призводить до значного зменшення когерентних шумів і поліпшенню, порівняно з інтерферометрами з точковими джерелами світла, якості одержуваних зображень.

До основних недоліків відносяться: складності роботи і настройки в білому і квазімонохроматіческом світлі, відсутність відеореєстрації зображень, розшифровка інтерферограмма виробляється оператором вручну. Це накладає відомі обмеження на точність і час вимірювань.

 

3.1. Будова iнтерференцiйного мiкроскопу

 

Принцип дії автоматизованого интерференцiонного мікроскопа заснований на інтерференції світлових пучків лазерного випромінювання, відбитого від опорного дзеркала і дзеркала, на якому вміщено вимірюваний фазовий об'єкт. Для автоматизації вимірювань реалізований метод дискретного фазового зсуву (метод фазових кроків) [14], внесеного за допомогою керованого від комп'ютера дзеркала на п'єзоелементі в опорному плечі мікроінтерферометр. Інтерферограмми при різних положеннях п'є зодзеркала за допомогою вбудованої ПЗС-телекамери окулярного або фотографічного каналу через плату введення зображення надходять в персональний комп'ютер (ПЕОМ), де проводиться їх автоматична обробка. В результаті якої, відновлюється двовимірний розподіл оптичної різниці ходу (ОРХ) або фазове зображення. Результати вимірювань відображаються на екрані комп'ютера. Для позиціонування знаходиться у полі зору мікроскопа об'єкта мається двохкоординатний предметний стіл з кроковими двигунами, керований від ПЕОМ через плату управління. На рис. 1. представлена блок-схема приладу. На рис. 2. представлений зовнішній вигляд мікроскопа.

Рис.1 Блок-схема автоматизованого iнтерференцiйного мікроскопу.

Рис. 2 Автоматизований інтерференційний мікроскоп

1- автоматизований двохкоординатний  предметний стіл;

2 - опорне дзеркало на  п'єзоелементі;

3,5 - ПЗС-камери;

4 - мікроінтерферометр МII-4;

6 - лазерний освітлювач  з низькою просторовою когерентністю.

Автоматизація вимірювань дозволила зменшити похибку вимірювання висоти профілю (СКО) до λ / 200 і скоротити час вимірювань до 20 с. Застосування лазерного джерела світла спростило налаштування інтерференційної картини, а також зробило можливим дослідження об'єктів, що вносять велику різницю ходу. Низька просторова когерентність джерела дозволила значно скоротити спекл-шум.

Мікроскоп забезпечує наступні технічні характеристики.

ТЕХНІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Лінійне поле зору в площині предмета, мкм:

при візуальному спостереженні з окуляром 15х............................... 320

на ПЗС камері окулярного каналу .............................................. 145х109

на ПЗС камері фотографічного каналу ...................................... 30х23

Збільшення, крат

на майданчику ПЗС камери окулярного каналу.................................. 33

на майданчику ПЗС камери фотографічного каналу ......................... 157

Максимальна вимірювана глибина рельєфу, мкм.............................. 20

Поздовжня роздільна здатність, в частках довжини хвилі λ ... ..λ / 200

Поперечна роздільна здатність мкм .................................................. 0,4

Час вимірювання та обробки, сек........................................ ................ 30

Число оброблюваних інтерферограм ... .............................................. . 5

Операційна система ................................................ ..... Windows 2000 / XP

Автоматизований інтерференційний мікроскоп застосовується для вирішення широкого класу вимірювальних задач в промисловості і біології. До промислових вимірiв відносять: безконтактне автоматичне вимірювання мікрорельєфу поверхні відображених об'єктів (рис 3)., товщини тонких плівок, висотних і крокових параметрів шорсткості та ін. Найбільш цікавим застосуванням автоматизованого iнтерференцiйного мікроскопа є біологічні дослідження. Наявність інтерференційного контрасту дозволяє вивчати живі незабарвлені клітини. До біологічних застосувань мікроскопа відносяться: морфометричнi дослідження біологічних об'єктів [3], оцінка стану популяції клітин [10], вимір сухої ваги клітин [4], вимірювання параметрів двопроменезаломления [8], динамічні фазові вимірювання [4].

На рис. 3 представлено фазове зображення еритроцита з параметрами сухої ваги і морфометрії: ефективний радіус 4,3 мкм, площа 58,7 мкм2, маса сухої речовини 48,3 пг.

Рис. 3 Фазове зображення еритроцита з параметрами сухої ваги і морфометрії.