Принцип роботи iнтерференцiйного мiкроскопу

 

4. Поєднання iнтерференцiйної мiкроскопiї з iншими видами мiкроскопiї

 

Для вимірювання локальних характеристик внутрішніх неоднорідностей мікрооб'єктів розроблені методи конфокальної скануючої мікроскопії [15,16], оптичної когерентної мікроскопії [17], а також методи, які використовують томографiчну реконструкцію. В конфокальному мікроскопі зображення внутрішніх перетинів формуються за рахунок сканування і просторової фільтрації випромінювання. Даний метод придатний лише для дослідження самосвітних (флуоресцентних) об'єктів. Оптична когерентна мікроскопія заснована на принципах оптичної когерентної томографії та представляє метод оптичної локації з використанням низькокогерентного випромінювання. Зображення перерізу виходить за рахунок інтерференції світла, розсіяного в тонкому шарі всередині об'єкта, і опорної хвилі. Товщина шару визначається довжиною когерентності джерела. Метод придатний для візуалізації градієнтів показника заломлення сильно розсіюють фазових об'єктів і шаруватих структур. Так як в мікроінтерферометрах фазових об'єктів вимірюваним є інтегральний параметр - ОРХ, то для реконструкції необхідно використовувати тільки принципи томографії.

Особливість інтерференційної обчислювальної мікротомографії полягає в рішенні технічно складної задачі вбудовування системи збору проекційних даних в інтерференційний мікроскоп [18]. Зондування об'єкта може здійснюватись або паралельним пучком світла, або розбіжним (конічним). У першому випадку формуються паралельні проекції, а в другому - конічні.

Можливі такі варіанти зондування (рис 4) .:

- поворот пучка зондуючого випромінювання щодо нерухомого об'єкта;

- обертання (нахил) об'єкта щодо нерухомого пучка зондуючого випромінювання.

Рис. 4. Схеми зондування в мікроскопії:

а, с) зі скануванням пучка зондуючого випромінювання щодо нерухомого об'єкта;

д, е) Cхема з рухом об'єкта відносно нерухомого пучка зондуючого випромінювання.

Схеми з поворотом пучка щодо нерухомого об'єкта розрізняються по траєкторії, яку описує зондуючий пучок щодо об'єкта, або області (сітці), на якій реєструються проекції. Відомі такі підходи:

- зовнiшньоосьове обертання точкової діафрагми в площині апертурної діафрагми мікрооб'ектіва [19]. Траєкторія зондування - окружність;

- одномірне зміщення точкового джерела в площині апертурної діафрагми конденсора та отримання похилого освітлення [20]. Траєкторія зондування - пряма (1D);

- використання матриці мікродзеркал DMD (Digital Micromirror Devices), поміщених в апертурної діафрагми мікрооб'ектіва, для створення похилого освітлення [21]. Схема може бути використана тільки для невеликих об'єктів. Траєкторія зондування - будь-яка двовимірна (2D);

- двовимірне зміщення точкового джерела в площині апертурної діафрагми мікрооб'ектіва та отримання похилого освітлення [22-24]. Траєкторія зондування - будь-яка двовимірна (2D).

Серед цих схем найбільшу перевагу мають схеми, що забезпечують двовимірну траєкторію. Всі підходи мають загальний недолік, що полягає в тому, що кут зондування об'єкта обмежений числовий апертурою мікрооб'ектіва і не перевищує 90 °.

Схеми зі скануванням об'єкта відносно нерухомого пучка (мікро-томографія) реалізовані для наступних варіантів обертання:

- обертання капіляра з перебуваючим всередині нього об'єктом [25];

- нахил об'єкта, поміщеного між двома покривними скельцями.

Ці схеми забезпечують великий кут зондування. Однак для їх реалізації необхідно, щоб вісь обертання проходила через об'єкт, інакше при обертанні він вийде із зони фокусування. Тобто необхідно створювати складні поворотні механізми, що забезпечують вирівнювання мікрооб'єкту щодо осі обертання.

Особливістю томографічного мікроскопа на основі схеми Линника є те, що ця схема забезпечує більшу числову апертуру. Кут зондування з іммерсійним об'єктивом досягав 90°. Для збору проекційних даних використовувалося похиле освітлення з різних ракурсів, що досягається за зміщення точкового джерела в площині апертурної діафрагми мікроскопа (рис. 5). В результаті об'єкт зондувати паралельним пучком по двовимірної траєкторії (2D). Для реконструкції фази використовувався метод фазових кроків [14], а для томографической реконструкції ітераційний алгоритм cART.

Рис. 5. Томографічний мікроскоп Линника:

1 - лазер;

2,3 - скануючий пристрій;

4 - сетодільник;

5,8 - мікрооб'єктиви;

6 - покривне скло;

7 - предметне дзеркало;

9 - п'єзоелемент;

10 - лінза;

11 - ПЗС-камера;

12 - ПЕОМ;

13 - препарат;

14 - дифузор;

15 - світлофільтр.

Були проведені експериментальні дослідження мікроскопа з клітинами крові - еритроцитами і лімфоцитами. На рис. 6 а приведені проекції лимфоцита, а на рис. 6 б реконструйована томограма лимфоцита.

Рис. 6.

а - проекції лiмфоцита,

б - томограми лiмфоцита.

Був розроблений томографічний мікроскоп на основі конфокального скануючого мікроскопа. В основі схеми лежить интерферометр Маха-Цендера, а модифікована схема конфокального мікроскопа вбудована в його предметний канал (рис. 8). Особливістю схеми є те, що об'єкт знаходиться поза області перетяжки, утвореною конфокальної парою двох ідентичних іммерсійних об'єктивів 6 і 7. Об'єкт зондується конусним пучком, а на реєстраторі 16 формується конусная проекція. Кут зондування - 100 °. Для реконструкції фази використовувався також метод фазових кроків, реалізований шляхом зміщення п'єзоелементом опорного дзеркала 9. Для збору проекційних даних використовувалася схема сканування об'єктом - об'єкт Про вчиняє плоскопараллельное рух разом з скануючим предметним столом, керованим від комп'ютера.

Рис. 7. Томографічний конфокальний мікроскоп:

1 - лазер;

2-4 - коліматор з просторовим  фільтром;

5,10 - светоделітель;

6,7 - імерсійним мікрооб'єктиви;

8,9 - дзеркала;

11,12 - поворотні призми;

13 - поляризатор;

14 - об'єктив;

15 - точкова діафрагма;

16 - ПЗС-камера;

О; О "-Об'єкт і його зображення.

Одержуваний набір конусних проекцій використовується для томографичної реконструкції. Проте можливі два шляхи відновлення томограми: або виробляти томографическую реконструкцію по конусним проекціям, або використовувати спеціальний алгоритм перерахунку конусних проекцій в паралельні проекції. Даний алгоритм полягає в тому, що при скануванні об'єкта в зоні конічного пучка за кожен крок сканування на детекторі реєструється один відлік паралельної проекції. Таким чином, кількість таких паралельних проекцій визначається числом елементів детектора, траєкторія зондування - геометрією розташування цих елементів, а число відліків в проекціях - числом кроків сканування. Дана схема є універсальною і може бути використана і для флуоресцентних об'єктів. Вона захищена патентом Росії [26].

Для досягнення більшого кута зондування необхідно використовувати імерсійним об'єктиви. Наприклад, якщо числова апертура дорівнюватиме NA = 1,3 і середовище, в якій знаходиться об'єкт, фізіологічний розчин (п = 1,33), то максимальний кут дорівнюватиме 78.

Однак якщо похиле освітлення об'єкту проходить через повітря (п = 1) і потім потрапляє в середовище, в якому знаходиться об'єкт (п = 1,33), то максимальний кут, який визначається числовий апертурою мікрооб'ектіва не досягається. Наприклад, навіть якщо кут нахилу падаючого пучка буде до 90° (косе освітлення), то кут в середовищі буде до 49º (для NA = 1,3). Тому для того, щоб досягти максимального кута зондування похиле освітлення має формуватися в деякій проміжній середовищі з показником заломлення більшим, ніж значення числової апертури мікрооб'ектіва.

Була розроблена конструкція дзеркального iммерсiонного конденсора (рис. 8).

Рис. 8. Конструкція дзеркального iммерсiйного конденсора:

1 - плоске дзеркало;

2,4 - захисні скла;

3 - иммерсия;

5 - корпус.

Паралельний пучок світла, що поширюється вздовж оптичної осі, проходить в проміжну середовище 3 з показником заломлення більшим ніж числова апертура иммерсионного об'єктива і відбивається від плоского дзеркала 1. Далі похилий пучок проходить через досліджуваний об'єкт, розташований в центрі конденсора на склі 4 із зовнішнього боку. Після проходження через об'єкта пучок потрапляє в іммерсійний мікрооб'єктив (не показаний).

Конденсор являє собою оптичний пристрій, що дозволяє висвітлювати досліджуваний об'єкт похилими плоскими пучками під різними ракурсами. Кут зондування визначається нахилом дзеркал і однаковий для усіх ракурсів. Кількість ракурсів одно числу дзеркал. В виготовленому експериментальному примірнику конденсора число дзеркал (ракурсів) дорівнює 10. Для того щоб забезпечити числову апертуру більше 1 в конденсор заливається імерсійна рідина з відповідним показником заломлення. Заливаючи рідини з різними показниками заломлення, можна міняти числову апертуру і відповідно кут зондування. Кут нахилу дзеркал був розрахований для NA = 1,3 і проміжної середовища п = 1,46 (гліцерин) і дорівнює 58º. Таким чином, розроблений конденсор дозволив отримувати зображення досліджуваного об'єкта під кутом зондування 156º.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ:

 

1. Вест Ч. Голографическая  интерферометрия. - М.: Мир, 1982.-504 с.

2. Скворцов Г.Е., Панов  В.А., Поляков Н.И., Федин Л.А. Микроскопы. -Машиностроение.- Ленинград.- 1969г.- 512 с.

3. Метелин В.Б., Минаев  В.Л., Валов А.Л., Конрадов А.А., Василенко  И.А., Бабакова С.В. Компьютерная фазово-интерференционная  микроскопия в биологии и медицине // Сборник научных трудов. -2003.- г.Красноярск.

4. Левин Г.Г., Ковалев А.А., Минаев В.Л., Сухоруков К.А. Оценка  точности измерения сухой массы  клетки на автоматизированном  интерференционном микроскопе //Измерительная  техника.- 2004.- С.62-67.

5. Dunn G. A. Transmitted-light interference microscopy: a technique born before its time // Proceedings of the Royal Microscopical Society.- 1998.- 33.-P.189-196.

6. Barer R. Determination of dry mass, thickness, solid and water concentration in livinq cells// Nature.- 1953.-172. - P.1097-1098.

7. Barer R., Joseph S. Refractometry of living cells. I. Basic principles// Quart.J.Microscop.Sci.. 1954.– 95. – P. 399-423.

8. Сребницкая Л.К., Вишняков  Г.Н., Нейман С.А., Рождественская  З.Е., Андреев О.А., Левин Г.Г. Двумерная  реконструкция карты двулучепреломления  саркомера скелетной мышцы в  релаксированном и ригорном состояниях  по данным интерференционной  микроскопии // Биофизика. – 2001. – Т.46. – Вып. 3. – С. 518-523.

9. Левин Г.Г., Булыгин Ф.В., Вишняков Г.Н. Когерентные осцилляции  состояния молекул белка в  живых клетках // Цитология. – 2005. –  Т.47. - №4. – С.348-356.

10. Стрелецкая Е.А., Цыба  Н.Н., Козинец Г.И., Левин Г.Г., Вишняков  Г.Н. Сопоставление интегральных  характеристик лимфоцитов здоровых  людей и больных хроническим лимфолейкозом // Клиническая лабораторная диагностика. – 2000. - №4. – С.21-23.

11. Тычинский В. П. Когерентная  фазовая микроскопия внутриклеточных  процессов // Успехи физических наук.- 2001.- Т.171.-№6.

12. Захарьевский А.Н., Кузнецова  А.Ф. Интерференционные биологические  микроскопы // Цитология.- 1961.- Т.3.- №2.- С.213-224.

13. Тычинский В.П. Компьютерный  фазовый микроскоп.- М.: Знание, 1989.- 64с.

14. Creath K. Phase-shifting speckle interferometry // APPLIED OPTICS.- 1985.-Vol. 24.- № 18.- P. 3053-3058.

15. Лежнев Э.И., Попова И.И., Кузьмин С.В., Слащев С.М. Конфокальная  сканирующая микроскопия: принципы, устройство, применение (часть 1) // Научное  приборостроение.-2001.-Т.11.-№2.- С.3-20.

16. Лежнев Э.И., Попова И.И., Кузьмин С.В., Слащев С.М. Конфокальная  сканирующая микроскопия: принципы, устройство, применение (часть 2) // Научное  приборостроение.-2001.-Т.11.-№3.- С.26-42.

17. Власов Н.Г. Получение  изображений на основе использования  когерентных свойств зондирующего  излучения. // ЖНПФ.- 1999. - т.4. - №5. - С.67-74.

18. Vishnyakov G.N., Levin G.G, Minaev V.L., Pickalov V.V., Likhachev A.V. Tomographic interference microscopy of living cells //Microscopy and Analysis.-2004.- 87.-p. 19-21.

19. Kawata S., Nakamura O., and Minami S. Optical microscope tomography. I. Support constraint. - J.Opt.Soc.Am. A, 1987, v.4, pp.292-297.

20. Vincent Lauer. Observation of biological objects using an optical diffraction tomographic microscope. – Proc. SPIE, 2000, vol. 4164, p. 122 – 133.

21. Dlugan A., MacAulay C., Lane P. MICROSCOPIC OPTICAL TOMOGRAPHY // 7th Congress of the European Society for Analytical Cellular Pathology, 1-5 April 2001, report Z003. http://www.bccrc.ca/ci/qm01_main.html

22. Vishnyakov G.N., Levin G.G., Zakerian C.S., Likhachov A.V., Pickalov V.V., Kozinets G.I., Novoderzhkina I.K., Streletskaya G.A. Three – dimensional limited – angle microtomography of blood cells: experimental results // Proc. SPIE.- 1998.- V.3261, P.159-164.

23. Vishnyakov G.N., Levin G.G., Zakerian C.S. Interferometric computed microtomography of 3D phase objects // Proc. SPIE.- 1997.- V.2984.- P.64-71.

24. Vishnyakov G.N., Levin G.G. Optical tomography of living cells using phase-shifting Linnik microscope // Proc. SPIE.- 1998.- V.3568.- P.197-200.

25. Carol J. Cogswell, Kieran G.Larkin, Hanno U. Klemm Fluorescence microtomography: Multi-angle image acquisition and 3D digital reconstruction // Proc. SPIE.- 1996.- V.2655.- P.109-115.

26. Патент №2140661 (Россия). Способ конфокальной сканирующей  трехмерной микроскопии и конфокальный  сканирующий томографический микроскоп. Левин Г.Г., Вишняков Г.Н., Булыгин  Ф.В., – заявл. 19.03.99.

 

ДОДАТКИ

Мiкрооб’єкти в iнтерференцiйнiй мiкроскопiї

Еритроцити

          Коловертка