Природа и происхождение вирусов

1.(5)Природа и происхождение вирусов.

По мере завоевания новых рубежей в познании химии, структуры, генетики  и экологии вирусов менялись и наши представления о природе и происхождении вирусов. Эти представления потерпели определенную эволюцию.

В начале о вирусах говорили как о паразитах, не способных размножатся на искусственных питательных средах. Затем в дополнение к этим представлениям вирусы стали определять как строгих внутриклеточных паразитов. В настоящее время паразитизм их определяют как паразитизм на генетическом уровне, поскольку взаимодействие вируса и клетки – это прежде всего взаимодействие двух геномов: вирусного и клеточного, исходом которого является либо поражение генома клетки и развитие острой вирусной инфекции или интеграция вирусного генома с геном клетки и развитие процессов лизогении или трансформации клетки.

Первая существенная особенность вирусов – это способность их осуществлять автономную репликацию в клетке – хозяине. Облигатный паразитизм вирусов обусловлен отсутствием у них двух важных систем: систем собственного энергообеспечения и белоксинтезирующего аппарата. Вторая особенность – дизьюнктивный путь их репродукции : отдельные компоненты синтезируются независимо друг от друга и затем обьединяются, формируя зрелый вирион.

С учетом современных данных вирусы можно рассматривать как агенты, обладающие облигатным внутриклеточным паразитизмом, способных к автономной репликации своего генома и передающиеся от клетки к клетке.

Новые факты по молекулярной биологии вирусов  позволили по новому смотреть на их природу и сущность процессов, вызываемых ими. Общепринятое ранее представление о том, что просто организованные вирусы состоят из белковых молекул, что они в своем составе содержат один вид нуклеиновой кислоты и не имеют собственных ферментов, уже утратило определяющее значение. Оказалось, что РНК-содержащие вирусы в ходе их репродукции в клетке синтезируют РНК, а некоторые РНК –содержащие вирусы(ретровирусы) синтезируют ДНК. Поэтому наличие одного вида нуклеиновой кислоты не является кардинальным свойством вирусов, отличающим их от всех других организмов.

Также ошибочным оказалось представление об отсутствии у вирусов собственных ферментативных систем. Оказывается все вирусы в ходе репродукции в клетке синтезируют собственные высоко специфические ферменты, которые обеспечивают их репликацию; у многих вирусов эти ферменты обнаружены в составе вирионов.

Единственный признак не претерпевший изменений, тот что вирусы не имеют собственных белоксинтезирующих систем, а используют клеточные системы.

В каждой группе вирусов можно обнаружить виды, сходные по строению, но вызывающие патологические процессы у далеко отстоящих в систематическом отношении хозяев. Например, группа рабдовирусов, имеющих пуле образное строение, включает, с одной стороны, вирусы бешенства, с другой, вирус желтой карликовости картофеля. Этот пример свидетельствует о высокой специализации паразитизма у вирусов, и  об универсальности их морфологической организации.

Прогресс вирусологии обязан введению новых методов и техники в вирусологические исследования. В начале для выделения вирусов использовались естественно восприимчивые и лабораторные животные и круг выделенных вирусов был небольшим. Использование для этой цели куриных эмбрионов значительно расширило этот круг, а с введением метода однослойных культур клеток возникли широкие возможности для выделения вирусов, дотоле неизвестных науке, и глубокого изучения репродукции их на молекулярно-биологическом уровне (В. М. Жданов, 1971).

Показана возможность репродукции вируса ядерного полиэдроза насекомых в культуре клеток куриного эмбриона, т.е. в клетках неспецифического хозяина. Эти факты иллюстрируют два диаметрально противоположных свойства вирусов: высокую специфичность функционирования их белков и универсальность потенций их генома, способного преодолевать видовые, исторически сложившиеся барьеры (В. М. Жданов, 1971).

Таким образом, природа вирусов двойственна. С одной стороны, вирусы обладают такими специфическими особенностями, как наличие одного типа нуклеиновой кислоты, дизьюктивный тип размножения и другие, которые не присущи никаким живым существам. Именно поэтому вирусы выделены в особое царство vira.

С другой стороны, вирусов в основном высказано четыре концепции. Первая: вирусы являются потомками бактерий, претерпевших регрессивную эволюцию. Автором этой концепции является Грин(1935), а до него Ш. Николь(1928), которые полагали, что существует некая лестница «регрессивной эволюции»: бактерия – фильтрующая форма бактерии – фильтрующиеся вирусы. Причем фильтрующиеся формы бактерий – эта та стадия «лестницы», когда еще возможно балансирование и еще возможен возврат к бактерийной форме и откуда мало-помалу отщепились истинные ультравирусы. Эту точку зрения позднее поддержал Бернет (1947).

Согласно этой концепции, в процессе упрощения организации и потери способности к самостоятельному метаболизму паразитические бактерии должны были дойти до такой стадии, когда окружающая их полупроницаемая оболочка стала пределом и помехой для дальнейшей эволюции. Потеря такой оболочки сняла эти ограничения, так как возникший вирус мог теперь свободно присоединять к себе компоненты хозяина и использовать ферменты последнего синтеза необходимых ему соединений. Риккетсии и хламидиоза, таким образом, составляют как бы переходный этап между бактериями и вирусами (Бернет, 1947).

Вторая концепция, вирусы – потомки доклеточных форм жизни, сохранившиеся вследствие перехода к паразитическому образу жизни (В.М. Жданов). Цепь логических рассуждений состоит в следующем. Вирусы, будучи относительно примитивными организмами, могли сохраниться до наших дней и даже прогрессировать, лишь перейдя к паразитическому образу жизни. Если считать, что первоначальными формами жизни являлись РНК-содержащие организмы, у которых генетический код и экспрессия были объединины, и то существование двух основных групп вирусов получает простое и естественное объяснение: наиболее древними являются РНК-вирусы, тогда как ДНК-вирусы являются более поздним образованием. Возможно, поэтому все известные вирусы растений содержат РНК, так как растения появились на Земле раньше животных.

В течение миллионов лет вирусы прогрессировали как как вместе со своими хозяевами, так и меняя хозяев, и этим объясняется разнообразие известных в настоящее время вирусов, а также их способность к паразитированию в организме определенных видов.

Необычайная скорость метаболических процессов в ходе репродукции фагов, не имеющая аналогий среди вирусов животных и растений, является также результатом специализации, вызванной тем, что цикл развития бактерий от деления до деления клеток измеряется нередко немногими десятками минут, поэтому фаги могли выжить, более короткий по времени цикл репродукции, либо выработав способность фиксироваться своей ДНК к ДНК бактерий, возлагая в этом случае на последнюю процесс своей репродукции. В зависимости от плотности бактериальной популяции фаг имеет либо литический механизм, либо лизогению.

Хорошо известно, что высокая степень специализации, благоприятствующая сохранению паразитического вида в популяции, хозяина, вместе с тем ограничивает возможность эволюции. Большинство вирусов – мало специализированные формы, имеют большие потенции к прогрессу. Видимо, поэтому многие вирусы, сходные по своему строению, поражают столь различных хозяев, метаболизм клеток которых имеет существенные различия.

Третья гипотеза допускает, что нуклеиновые кислоты возникли абиогенным путем, независимо от живых систем (Белозерский, 1964). С этой гипотезой вполне гармонирует и гипотеза о вирусах как потомках доклеточных форм жизни, сохранившихся вследствие перехода к паразитическому существованию. Еще в 1940г. Н.Ф. Гамалея писал о том, что «первобытными живыми существами были не бактериеподобные, а еще более мелкие формы, напоминавшие современные вирусы». Эту точку зрения сейчас разделяют ряд крупных вирусологов. Представляется вполне вероятным существование древних доклеточных форм жизни, давших начало, с одной стороны клеткам, с другой, современным вирусам, позднее поселившимся в эти клетки и приспособившимся к существованию в них (В. М. Жданов, 1953).В дальнейшем вирусы эволюционировали вместе со своими хозяевами и меняя своих хозяев.

Четвертая концепция, высказанная Лурия и Дарнелом (1967) о том, что вирусы – отделившиеся компоненты клетки, допускает, что некоторые ДНК-вирусы вполне могли возникнуть из эписом в результате приобретения генетической информации, необходимой для построения биологического чехла. Свифт и Уолстенхоум (1969) полагают, что некоторые вирусы могли возникнуть из таких клеточных органелл, как хлоропласты и митохондрии, которые, вероятно, сами произошли от бактерий. Мелкие вирусы, возможно, произошли из компонентов клеток позвоночных, в то время как герпес вирусы, поксвирусы и, вероятно, аденовирусы имеют иное происхождение. Эти крупные вирусы могли произойти из нуклеиновых кислот организмов, принадлежащим к другим типам, или в результате дегенерации микроорганизмов.

Гипотеза регрессивной эволюции ( Грин, 1935; Лейдлоу, 1938; Ниидхэм, 1938; Львов, 1943; Бернет, 1947) лучше согласуется с фактами и закономерностями, лежащими в основе эволюционной теории. Некоторые бактерии, перейдя к паразитическому образу жизни, постоянно упрощались в своей структуре, пройдя стадии, сходные с риккетсиями, и , наконец, стали вирусами.

Наиболее слабым местом этой гипотезы является существование РНК-вирусов. Непонятным остается, как в ходе регрессивной эволюции могла быть утрачена ДНК и заменена РНК. Гипотеза регрессивной эволюции оставляет этот вопрос открытым. И лишь работы Гершензона (1960) и Темина (1964) на двух совершенно разных моделях доказывают возможность индукции синтеза ДНК с помощью РНК и открывают возможность объяснить появление РНК-вирусов. С момента открытия обратной транскриптазы (1970) эта концепция обретает большее число сторонников.

Гипотеза «заблудившихся генов» или клеточных органоидов (например, рибосом) основана на неоднородности вирусов, нуклеиновые кислоты которых имеют аналоги в клетках: у РНК-вирусов имеется некоторое сходство с рибосомами, у ДНК-вирусов – с геномами. Кроме того, метаболизм вирусов связан с метаболизмом клетки. Однако этот признак присущ и другим возбудителям.

Однако данная концепция не канула в Лету. Смит и Кенайн (1972) разделяют концепцию о возникновении вирусов из обломков клеточных нуклеиновых кислот, возникающих под действием разных стрессов и попадающих в клетки чужеродного организма. В ходе дальнейшей эволюции вирусы под действием естественного отбора постепенно утрачивают свою вирулентность, и поэтому по степени вирулентности можно об относительном филогенетическом возрасте вируса. Находимые в клетках различных здоровых организмов вирусоподобные частицы представляют либо завершённый продукт эволюции вируса, либо возникают аналогично вирусам из обломков клеточных нуклеиновых кислот, но лишены способности горизонтального распространения и поэтому не могут попасть в чужеродного хозяина, где проявилась бы их вирулентность в отношении его клеток, отличающихся биохимически от клеток, где эти частицы возникли.

Близко к гипотезе регрессивной эволюции примыкает точка зрения Я. Я. Цилинского (1971) о происхождении арбовирусов. Согласно современным представлениям, арбовирусы произошли от вирусов-симбионтов кишечника комаров, не обладающих способностью проникать в слюнные железы и активно размножатся в организме позвоночных.

В настоящее время имеется еще два крупных раздела вирусологических исследований. Во-первых, определение места и роли вирусов в эволюции живого и во-вторых, использование вирусов для генно-инженерных работ.

2.(21)Культивирование вирусов в культуре клеток (условия культивирования, солевые растворы и питательные среды).

Для выделения вирусов, их идентификации, накопления в качестве антигенов при изготовлении диагностикумов и противовирусных вакцин в современных вирусологических лабораториях и на биофабриках широко используют культуры клеток. Культура клеток применяется в научных исследованиях по генетике вирусов, при клонировании, получении ts-мутантов вирусов, селекции, контроле живых противовирусных вакцин, изучении проблемы вирус – клетка и в других аспектах. Внедрение культуры клеток в вирусологическую практику отодвинуло на задний план преимущественное использование лабораторных животных и куриных эмбрионов. В настоящее время ни одна современная вирусологическая лаборатория не может обойтись без группы культивирования клеток.

Культура тканей – понятие более широкое, включающее и понятие культура клеток. Исторически методу  культуры клеток предшествовали многолетние и весьма трудоемкие методики использования культуры тканей.

Наиболее широко распространено культивирование клеток в монослое, состоящее в том, что с помощью ферментативной обработки изолируют живые клетки из свежих тканей, переносят их в специальные сосуды для культивирования в условиях подкормки этих клеток соответствующей питательной средой. Метод монослойной культуры позволяет выращивать клетки на стенках сосудов.

Условия культивирования клеток. Для роста и размножения клеток вне организма необходим комплекс физико-химических факторов(t культивирования, концентрация водородных ионов, определенное содержание неорганических соединений, углеводов, аминокислот, белков, витаминов, кислорода и углекислоты).

Для клеток млекопитающих и птиц оптимальная температура размножения колеблется в пределах 36 – 38,5 °С. Для поддержания жизнедеятельности клеток большое значение имеет солевой состав питательной среды, создающий необходимую буферность и изотоничность. Для роста клеток животных обязательно присутствие в среде ионов Na+,K+,Ca++,Mg++, Clˉ, карбонатов и фосфатов. Эти ионы входят в состав всех физиологических солевых растворов. Часть из них необходима не только для поддержания осмотического давления (натрий, кальций), но и для обеспечения функций буфера в среде. Бикарбонатный буфер можно заменить другими буферными растворами. Присутствие ионов кальция и магния необходимо также для прикрепления клеток на поверхности стекла.

Оптимальный рост и развитие клеток обеспечивается при  рН 7,2-7,4. Значительные отклонения рН среды от указанного выше оптимума отрицательно сказываются на росте культуры клеток.

Для роста клеток необходимы кислород и углекислота, при участии которых образуется энергия и осуществляется биосинтез составляющих клетку компонентов.

Для роста и развития клеток вне организма необходимо присутствие в питательной среде тех аминокислот, которые не могут быть синтезированы клеточными культурами. К таким основным аминокислотам относятся: глютамин, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, аргинин, лизин, гистидин, триптофан, метионин, треонин, цистин, тирозин.