Техніка культивування мікроорганізмів

МІНІСТЕРСТВО  АГРАРНОЇ ПОЛИКИ ТА ПРОДОВОЛЬСТВА УКРАЇНИ

ЖИТОМИРСЬКИЙ  НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРОЕКОЛОШІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

 

Екологічний факультет

 

 

 

 

 

Реферат

на тему: « Техніка культивування мікроорганізмів »

 

 

 

Виконав:

студентка 2 курсу 2 групи 

екологічного факультету

Семенчук А.І.

Перевірив:

Трохименко В.З.

 

 

 

Житомир

2013

 

ЗМІСТ:

1.Вступ

2.Технологічні основи біотехнологічних виробництв.

3.Безперервне культивування.

4.Турбидостатний режим культивування.

5.Висновок

6.Список використаної літератури.

 

Вступ

 

Клітинні культури знаходять  усе більш широке застосування в  різних областях біології й медицини. Їх використають при рішенні таких  загально біологічних проблем, як з'ясування механізмів діференціровки й проліферації, взаємодії кліток із середовищем, адаптації, старіння, біологічної рухливості, злоякісної трансформації. Важливу  роль грають клітинні культури в біотехнології  при виробництві вакцин і біологічно активних речовин. Культури кліток застосовують для діагностики й лікування  спадкоємних захворювань, як тест-об'єкти при випробуванні нових фармакологічних  речовин. Використання культивованих  кліток поза організмом для діагностики  хвороб є логічним продовженням методу біопсії, при якій вилучений із організму  фрагмент тканини піддають негайному (переважно морфологічному) дослідженню.

Однак завдяки культивуванню  можливості дослідження й діагностики  розширюються практично безмежно, тому що є можливість оцінки не тільки морфологічних  і біохімічних змін, але також  змін у поводженні кліток, їхніх  реакцій на різні агенти, у тому числі на лікарські впливи. Відтворення  культивованого клітками в ряді поколінь якого-небудь дефекту або зміни, властивого кліткам іn vіvo, свідчить про спадкоємну природу цього  дефекту або зміни. Саме завдяки  цій обставині культивовані клітки є коштовним об'єктом фізіологічної  генетики. Останнім часом зріс інтерес  до роботи з культивованими клітками, особливо у фахівців із застосування моноклональних антитіл, одержуваних  методами гибридомної технології.

Культивування мікроорганізмів - створення штучних умов для підтримки  процесів життєдіяльності й розмноження  мікробів іn vіtro. Із цією метою використають живильні (культуральні) середовища. Для  одержання мікроорганізмів або  продуктів їхньої життєдіяльності  в промислових масштабах використають методи глубинного й безперервного  культивування.

2. Технологічні основи біотехнологічних виробництв

Найважливішим завданням будь-якого біотехнологічного  процесу є розробка й оптимізація  технології й апаратури для нього. При організації біотехнологічних виробництв частково був запозичений  досвід розвиненої на той час хімічної технології. Однак біотехнологічні  процеси мають істотну відмінність від хімічних у силу того, що в біотехнології використають більш складну організацію матерії - біологічну. Кожний біологічний об'єкт (клітка, фермент) - це автономна саморегулююча система.

Природа біологічних процесів складна й  далеко не з'ясована остаточно. Для  мікробних популяцій, наприклад, характерна істотна гетерогенність по ряду ознак - вік, фізіологічна активність, стійкість  до впливу несприятливих факторів середовища. Гетерогенність також може бути обумовлена наявністю поверхонь фаз і  неоднорідністю умов середовища.

У загальному виді будь-який біотехнологічний процес включає три основні стадії: предферментаційну, ферментаційну й постферментаційну. Принципова схема реалізації біотехнологічних процесів у загальному виді може бути представлена блок-схемою, у якій зроблена спроба охопити всі варіанти ферментаційних процесів.

На предферментаційній стадії здійснюють зберігання й підготовку культури продуцента (інокулята), одержання  й підготовку живильних субстратів і середовищ, ферментаційних апаратур, технологічної й рециркуліруємої  води й повітря. Підтримка й підготовка чистої культури є дуже важливим моментом предферментаційної стадії, тому що продуцент, його фізіолого-біохімічні характеристики й властивості визначають ефективність усього біотехнологічного процесу.

У відділенні чистої культури здійснюють зберігання виробничих штамів і забезпечують їх реактивацію й наробіток інокулята  в кількостях, необхідних для початку  процесу. При вирощуванні посівних доз інокулята застосовують принцип  масштабування, тобто проводять  послідовне нарощування біомаси  продуцента в колбах, суліях, далі в  серії послідовних ферментерів. Кожний наступний етап даного процесу  відрізняється по обсягу від попереднього звичайно на порядок. Отриманий інокулят по стерильній посівній лінії направляється  далі в апарат, у якому реалізується ферментаційна стадія.

Готування живильних середовищ здійснюється у спеціальних реакторах, обладнаних мішалками. Залежно від розчинності  й сумісності компонентів середовищ  можуть бути застосовані окремі реактори. Технологія готування середовищ  значно ускладнюється, якщо в їхній  склад входять нерозчинні компоненти.

У різних біотехнологічних процесах застосовуються різні по походженню й кількостям субстрати, тому процес їхнього готування  варіюється. Тому дозування живильних  компонентів підбирається й здійснюється індивідуально на кожному виробництві  відповідно до Технологічного регламенту конкретного процесу. Як дозуюче  встаткування при цьому застосовуються вагові й об'ємні пристрої, використовувані  в харчовій і хімічній промисловості. Транспорт речовин здійснюється насосами, стрічковими й шнековими  транспортерами. Сипучі компоненти подають  у ферментери за допомогою вакуумних  насосів. Часто застосовують принцип  попередніх сумішей, тобто солі попередньо розчиняють і потім транспортують  по трубопроводах, дозуючи їхню подачу по обсягу. У силу виняткової розмаїтості  біотехнологічних процесів і застосовуваних для їхньої реалізації середовищ, методів  і апаратури розгляд даних  елементів далі буде пов'язаний з  конкретними біотехнологічними  виробництвами.

Стадія  ферментації є основною стадією  в біотехнологічному процесі, тому що в її ході відбувається взаємодія  продуцента із субстратом і утворення  цільових продуктів (біомас, ендо- і  екзопродуктів). Ця стадія здійснюється в біохімічному реакторі (ферментері) і може бути організована залежно  від особливостей використовуваного  продуцента й вимог до типу і якості кінцевого продукту різними способами. Ферментація може проходити в  строго асептичних умовах і без дотримання правил стерильності (так звана "незахищена" ферментація); на рідких й на твердих  середовищах; анаеробне й аеробне. Аеробна ферментація, у свою чергу, може протікати поверхово або  глубинно (у всій товщі живильного) середовища.

Культивування біологічних об'єктів може здійснюватися  в періодичному й проточному режимах, напівбезупинно з підживленням субстратом. При періодичному способі культивування  ферментер заповнюється вихідним живильним  середовищем з інокулятом мікроорганізмів .

Протягом  певного періоду часу в апараті  відбувається взаємодія мікроорганізмів  і субстрату, зо супроводжується  утворенням у культурі продукту (Х + SP).

Біохімічні  перетворення в цьому апараті  тривають від десятків годин до декількох  діб. Регуляція умов усередині ферментера - найважливіше завдання періодичного культивування мікроорганізмів. У  ході періодичної ферментації вирощувана культура проходить ряд послідовних стадій: лаг-фазу, експонентну, уповільнення росту, стаціонарну й відмирання. При цьому відбуваються істотні зміни фізіологічного стану біооб’єкта, а також ряду параметрів середовища.

Цільові продукти утворюються в експонентній (первинні метаболіти - ферменти, амінокислоти, вітаміни) і стаціонарній (вторинні метаболіти - антибіотики) фазах, тому залежно від цілей біотехнологічного  процесу в сучасних промислових  процесах застосовують принцип диференційованих режимів культивування.

У результаті цього створюються умови для  максимальної продукції того або  іншого цільового продукту. Періодично ферментер спорожняють, роблять  виділення й очищення продукту, і  починається новий цикл. 

3. Безперервне культивування 
Безперервний процес культивування мікроорганізмів має істотні переваги перед періодичним. Безперервна ферментація здійснюється в умовах сталого режиму, коли мікробна популяція і її продукти найбільш однорідні. Застосування безперервних процесів ферментації створює умови для ефективного регулювання й керування процесами біосинтезу. Системи безперервної ферментації можуть бути організовані за принципом повного витиснення або повного змішання. Перший приклад - так звана тубулярна культура. 
  
Процес ферментації здійснюється в довгій трубі, у якій з одного кінця безупинно надходять живильні компоненти й інокулят, а з іншого з тією ж швидкістю випливає культуральна рідина. Дана система проточної ферментації є гетерогенною.  
При безперервній ферментації у ферментах повного змішання (го-могенно-проточний спосіб) у всій масі ферментаційного апарата створюються однакові умови. Застосування таких систем ферментації дозволяє ефективно управляти окремими стадіями, а також всім біотехнологічним процесом і стабілізувати продуцент у практично будь-якому, необхідному експериментаторові або біотехнологу стані. Керування подібними установками здійснюється двома способами. 
  
Турбидостатний спосіб базується на вимірі мутності потоку, який виходить. Вимір мутності мікробної суспензії, викликаний ростом кліток, є мірою швидкості росту, з якою мікроорганізми виходять із біореактора. Це дозволяє регулювати швидкість надходження у ферментер свіжого живильного середовища. Другий метод контролю, - хемостатний, простіше. Керування процесом у хемостаті здійснюється виміром не вихідного, а вхідного потоку. При цьому концентрацію одного з компонентів живильного середовища (вуглець, кисень, азот), що надходить у ферментер, установлюють на такому рівні, при якому інші живильні компоненти перебувають у надлишку, тобто концентрація, що лімітується біогенного елемента обмежує швидкість розмноження кліток у культурі.   
Безперервний процес культивування мікроорганізмів має істотні переваги перед періодичним.   
Для безперервного (проточного) культивування, на відміну від періодичного, культури характерна постійна подача свіжих живильних компонентів зі швидкістю, рівною швидкості видалення середовища з культури (відкрита система). Якщо культура добре перемішується, то проби, узяті з будь-якої частини ферментера, будуть однакові по біомасі й концентрації субстрату. По складу вони ідентичні також культуральній рідини, що випливає з ферментера.  
При безперервному культивуванні теоретично бактерії ростуть експоненціально в умовах постійної подачі свіжого середовища й видалення частини кліток разом зі старим середовищем, так що обсяг культури згодом не міняється.  
Загалом кажучи, постійна концентрація кліток для безперервного культивування не обов'язкова. Однак у більшості робіт з вивчення кількісних аспектів безперервного культивування описуються системи з постійною концентрацією біомаси. Розглянуті нижче принципи відносяться тільки до безперервного культивування в рівноважному стані. 
Термін "рівноважний стан" часто вживають у літературі у зв'язку з безперервним культивуванням; буквально він означає, що під час дослідження не відбувається зміни стану культури. Насправді це визначення занадто широке, оскільки на практиці при безперервному культивуванні деякі параметри можуть мінятися, тоді, як інші при цьому залишаються постійними. Тому безперервну культуру в рівноважному стані визначають як культуру з постійною концентрацією біомаси в певний період спостереження. На противагу цьому в періодичній культурі постійна концентрація розчиненого кисню підтримується змінами, що відбуваються в середовищі, але зміст у ній біомаси міняється. 
Безперервне культивування в рівноважному стані можливо тільки в тому випадку, коли всі вступні потоки, необхідні для нагромадження біомаси, точно збалансовані з потоками, що беруть участь у виході біомаси із системи. 
Теоретично обсяг чисто безперервної культури не міняється (на практиці він підданий незначним коливанням). Отже, швидкості подачі середовища у ферментер, і виходу культури з нього повинні бути однаковими. Нарешті, оскільки питома швидкість загибелі кліток майже завжди значно менше питомої швидкості їхнього росту, величину швидкості можна не брати до уваги. Виключення із цього правила спостерігається тільки при дуже низьких швидкостях росту мікроорганізмів, у присутності токсичних речовин або у випадку культивування в екстремальних біофізичних умовах. 
Іншими словами, питома швидкість росту популяції у ферментері визначається швидкістю розведення D яка дорівнює p/y.  
Існує багато типів безперервного культивування. В обговоренні ми обмежимося двома основними типами безперервного культивування: "хемостатом", у якому стан рівноваги досягається шляхом регулювання надходження субстратів, що лімітують ріст, і "турбидостатом", у якому стан рівноваги досягається шляхом видалення біомаси й заміщення її свіжим середовищем зі швидкістю, що відповідає росту культури.

4. Турбидостатний режим культивування 
Турбидостатне культивування являє собою найпростішу систему безперервного культивування. Концентрація кліток при турбидостатному культивуванні регулюється постійним підстроюванням швидкості надходження живильних компонентів. Концентрацію біомаси в турбидостаті вибирає оператор, а швидкість розведення й концентрація субстратів підтримується так, щоб зберігався заданий рівень біомаси. 
Принцип роботи турбидостата заснований на підтримці постійної щільності бактеріальної популяції в апараті, безперервна культура постійно перебуває в найбільш бажаній фазі росту, при якій забезпечується максимальний вихід біологічно важливих з'єднань або біомаси. Турбидостатне культивування здійснюють тоді, коли лімітований фактор не відомий або в ньому немає необхідності, тому субстрат додається у ферментер у надлишку. Надлишок всіх живильних компонентів середовища робить роботу турбидостата стабільною.  
Турбидостат дозволяє регулювати систему в широких інтервалах концентрації біомаси при швидкостях розведення, близьких до Dкр. Швидкість розведення в турбидостаті дорівнює питомої швидкості росту за умови, що X залишається постійною величиною. Сигналом для подачі й регулювання швидкості потоку середовища може бути не тільки оптична щільність, але й будь-який параметр середовища, що піддається виміру електродом, що переводить величину вимірюваного параметра у величину електричного потенціалу.  
Оскільки основні метаболічні функції (поглинання бактеріями кисню, виділення вуглекислого газу, зміна кислотності), тісно зв'язані зі швидкістю росту кліток і, в остаточному підсумку, з питомою швидкістю росту культури, саме ці показники частіше інших використають як вимірювані змінні при регулюванні потоку середовища. 
Турбидостатне культивування може здійснюватися одностадійно й двустадійно, тобто в одному ферментері або двох послідовно з'єднаних між собою ферментерах.  
Одностадійне турбидостатне культивування використається для одержання максимальної швидкості росту. При двустадійному турбидостатному культивуванні в другому ферментері, можливо, відтворити фазу росту, пов'язану із синтезом вторинних метаболітів (фазу стаціонарного максимуму). 
При низьких концентраціях субстрату й при низькій концентрації кліток можна повернути у ферментер частину біомаси, що випливає з нього. Повернення підвищує концентрацію кліток і прискорюють процес. Варіантів повернення біомаси може бути кілька. Сепарують культуру, що випливає, і згущену частину повертають у ферментер. Установлюють різні фільтруючі пристрої, що дозволяють випливати культуральній рідини, але затримуючі клітки.  
Турбидостатнмй режим культивування базується на прямому контролі концентрації біомаси. Найпоширенішим методом її визначення є вимір світорозсіювання за допомогою фотоелементів. Підвищення концентрації кліток і відповідно до оптичній щільності автоматично прискорює проток рідини й навпаки.  
По своїй конструкції турбидостати відрізняються від хемостатів лише системами контролю швидкості протоки. Хемостати застосовуються в процесах, що характеризуються малою протокою, коли концентрація кліток змінюється незначно зі зміною швидкості протоки, що полегшує саморегулювання системи.  
Технічно найпростіший турбидостат відрізняється від хемостата тільки наявністю датчика оптичної щільності й виконавчого механізму (дозатора живильного) середовища, що включається при досягненні культурою заданої щільності. Оптична система дозволяє підтримувати стійкий режим при різниці щільності до й після розведення на рівні нижче 1% від заданої щільності, що дозволяє вважати динаміку щільності практично незмінною й користуватися диференціальними рівняннями для її формального опису. 
Турбидостат являє собою систему культивування, що включає реактор, у який безупинно подається живильне середовище, з якого відбирається культура. Швидкості подачі середовища й відбору культури повинні бути рівні, що забезпечує сталість обсягу культури.  
Один з найпростіших варіантів турбидостата з автоматичною підтримкою обсягу культури в реакторі зображений на схемі. Культиватор для вирощування складається з освітлюваного реактора (фотореактор), що барботирується газоповітряною сумішшю, що містить вуглекислий газ. Барботаж забезпечує перемішування культури, вуглецеве харчування кліток і відвід кисню. З ємності з живильним середовищем, з постійно заданою швидкістю, у реактор надходить середовище. Через отвір у реакторі, розташований на певній висоті, культура безупинно зливається в ємність для збору врожаю. Це забезпечує при постійній швидкості доливки сталість швидкості зливу і їхню рівність. Крім того, така система автоматично підтримує постійний обсяг культури у фотореакторі. 
Система для турбидостатных культур 
  
Область використання турбидостатів - високі швидкості розведення, що обумовлюють швидку й різку зміну концентрації біомаси. З технічної точки зору турбидостат може застосовуватися тільки для культивування одноклітинних мікроорганізмів. При тривалому культивуванні в турбидостаті виникає досить серйозна проблема, пов'язана із прилипанням кліток до фотоелемента.  
Однак є й певні переваги. Так, наприклад, якщо засівається змішана культура, то в турбидостаті автоматично відбирається більш швидко зростаючий вид, що може використатися для запобігання від масивного зараження сторонньою мікрофлорою (якщо, звичайно, вона росте повільніше) і селекції певних форм.  
Безперервне культивування в одному біореакторі називається одностадійним. Багатостадійне вирощування передбачає послідовне або каскадне розташування біореакторів, що дозволяє забезпечувати впровадження принципу диференційованих режимів у безперервні біотехнологічні процеси, засновані на створенні системи біореакторів. При розробці нових біотехнологічних процесів спочатку прибігають до періодичного культивування.  
На безперервний режим поки що переведене невелике число процесів, однак перспективність його не викликає сумнівів, незважаючи на більш складні конструкції апаратів і систем контролю (іншими словами, на більш солідні капіталовкладення). Звичайно, і періодичне культивування ще не вичерпало своїх можливостей. Поки що вибір режиму (періодичне або безперервне культивування) підкоряється (та й буде підкорятися надалі) міркуванням економічної доцільності. 
При турбидостатному режимі завдяки позитивному зворотному зв'язку між культурою, що розмножується, і системою подачі свіжого живильного середовища, яке протягом тривалого часу може підтримуватися не лімітована ззовні швидкість росту, що залежить від швидкості синтетичних процесів, що протікають у клітці. 
Найбільш уразливим місцем культивування в турбидостаті є точність регулювання біомаси. Більшість старих методів регулювання щільності популяції засновані на оптичному вимірі (у неуважному або минаючому світлі) за допомогою фотоелектричного датчика.  
Недоліком цих методів є перешкоди, викликувані піною й пухирцями, які утворюються при аерації, а також ростом кліток на стінках ферментера й, що більш важливо, на оптичному вимірювальному пристрої. Якщо від перешкод, викликуваних пухирцями, можна позбутися, використовуючи зовнішню проточну кювету, то піна створює серйозні проблеми. Заростання бактеріями оптичних поверхонь можна частково перебороти їхнім протиранням, однак, це малоефективний прийом. Покладають надії на нові методи волоконної оптики, однак вони ще не апробовані. 
Термін "турбидостат" ставиться до будь-якого методу, при якому щільність кліток підтримується на постійному рівні. Він містить у собі методи, засновані на змінах метаболізму. Оскільки основні метаболічні функції (такі, як поглинання бактеріями кисню, виділення двоокису вуглецю й у деяких випадках зміна рН) тісно зв'язані зі швидкістю росту кліток і, в остаточному підсумку, з питомою швидкістю росту культури, їх можна використати як показові змінні при регулюванні потоку середовища. 
Теоретично як регульований параметр при культивуванні в турбидостаті може бути використаний будь-який параметр, що піддається виміру. На практиці ж у цій якості використають тільки ті параметри, які тісно пов'язані з ростом кліток. Введення складних комплексів ферментер - ЕОМ забезпечить більш високий рівень використання турбидостатної теорії, але ці комплекси вимагають подальших розробок.