Автор работы: Пользователь скрыл имя, 06 Ноября 2011 в 21:10, реферат
Трансляцией называют осуществляемый рибосомой синтез белка из аминокислот на матрице информационной (или матричной) РНК (иРНК или мРНК).
Механизм
Синтез белка является основой жизнедеятельности клетки. Для осуществления этого процесса в клетках всех без исключения организмов имеются специальные органеллы — рибосомы. Рибосомы представляют собой рибонуклеопротеидные комплексы, построенные из 2 субъединиц: большой и малой. Функция рибосом заключается в узнавании трёхбу
Цикл транскрипции начинается с присоединения РНК-полимеразы к промотору - строго определенному участку ДНК, с которого начинается синтез РНК.
Следующая стадия, инициация, требует наличия субстратов РНК-полимеразы нуклеозидтрифосфатов и заключается в образовании первых нескольких звеньев цепи РНК. Матрицей для синтеза РНК у эукариот служит ДНК-гистоновый комплекс, а не свободная ДНК, как это имеет место у прокариот.
За стадией инициации начинается элонгация. В момент, который считается концом инициации и началом элонгации, от РНК-полимеразы отделяется сигма-субъединица. По мере движения РНК-полимеразы по матрице впереди нее происходит расплетание, а позади - восстановление двойной спирали ДНК. Одновременно освобождается очередное звено растущей цепи РНК из комплекса с матрицей и РНК-полимеразой.
Завершается синтез РНК в строго определенных участках матрицы - терминаторах, где происходит отделение от ДНК и готовой РНК, и минимальной РНК-полимеразы, которая, объединившись со свободной сигма-субъединицей, может вступить в следующий цикл транскрипции.
Новообразованная РНК упаковывается в рибонуклеопротеиновые частицы.
Инициация требует наличия субстратов РНК-полимеразы нуклеозидтрифосфатов и заключается в образовании первых нескольких звеньев цепи РНК. Первый нуклеотид входит в состав цепи, сохраняя свою трифосфатную группу, а последующие присоединяются к 3'-OH-группе предыдущего с освобождением пирофосфата. На стадии инициации РНК-продукт связан с матрицей и РНК-полимеразой непрочно и с высокой вероятностью может освобождаться из комплекса. В этом случае РНК-полимераза, не покидая промотора, снова инициирует РНК. Такой синтез ди-, три- и более длинных олигонуклеотидов называют абортивной инициацией в противоположность продуктивной (т.е. завершающейся образованием полноценного РНК-продукта ) инициации. Когда РНК-продукт достигает критической длины (от 3 до 9 нуклеотидов на разных промоторах), абортивная инициация полностью прекращается, транскрибирующий комплекс стабилизируется и уже не распадается до тех пор, пока синтез молекулы РНК не будет доведен до конца. Примерно в этот же момент, который считается концом инициации и началом элонгации, от бактериальнойРНК-полимеразы отделяется сигма- субъединица.
Эффективность инициации на разных промоторах, их "сила", существенно различается: если с некоторых промоторов инициируется всего одна-две молекулы РНК за период деления клетки, то с других (например, с промоторов генов рибосомных РНК ) инициация происходит раз в одну-две секунды. Частота, с которой инициируется транскрипция при насыщающей концентрации субстратов, зависит главным образом от равновесной константы образования закрытых промоторных комплексов и константы скорости превращения закрытого комплекса в открытый. Для самых сильных промоторов обычно характерны высокие значения обеих констант (высокое сродство РНК полимеразы к промотору и быстрый переход промоторного комплекса в активное открытое состояние). Для слабых промоторов характерны низкие значения этих величин. Слабость промоторов с низким сродством к РНК-полимеразе особенно заметна при низких концентрациях РНК-полимеразы и может быть скомпенсирована при ее высоких концентрациях. Промотор с низким сродством к РНК-полимеразе может быть достаточно сильным, если ему присуща высокая скорость перехода в открытое состояние. Сила большинства промоторов увеличивается с увеличением степени отрицательной сверхспирализации ДНК. Это объясняется тем, что отрицательная сверхспирализация облегчает расплетание ДНК и тем самым переход в открытый промоторный комплекс. Существуют, однако, промоторы, сила которых не зависит или даже уменьшается с увеличением степени сверхспирализации. Этому эффекту объяснения пока не найдено.
Инициация транскрипции начинается со сборки на промоторе прединициационного комплекса, в состав которого входят молекулы РНК-полимеразы и матричной ДНК. Если в случае РНК-полимеразы E. coli и других прокариот для осуществления этого процесса нет необходимости в присутствии других белковых факторов, то механизм сборки инициационного комплекса с участием РНК-полимеразы II носит более сложный характер.
Существуют две модели инициации транскрипции РНК- полимеразой II. В соответствии с одной из них на промоторе происходит постепенная (ступенчатая) сборка инициационного комплекса из отдельных компонентов. Другая модель акцентирует внимание на то, что Pol II может входить в состав инициационного комплекса в виде холофермента, состоящего из многих субъединиц. Сборка такого комплекса начинается с последовательного связывания с промотором основных факторов транскрипции.
Момент перехода РНК-полимеразы от инициации транскрипции к элонгации точно не определен. Три основных биохимических события характеризуют этот переход в случае РНК-полимеразы E.coli : отделение сигма-фактора, первая транслокация молекулы фермента вдоль матрицы и сильная стабилизация транскрипционного комплекса, который кроме РНК- полимеразы включает растущую цепь РНК и транскрибируемую ДНК. Эти же явления характерны и для РНК-полимераз эукариот. Переход от инициации к элонгации сопровождается разрывом связей между ферментом, промотором, факторами инициации транскрипции, а в ряде случаев - переходом РНК-полимеразы в состояние компетентности в отношении элонгации (например, фосфорилирование CTD-домена у РНК-полимеразы II ). Фаза элонгации заканчивается после освобождения растущего транскрипта и диссоциации фермента от матрицы ( терминация ).
На стадии элонгации в ДНК расплетено примерно 18 н.п. Примерно 12 нуклеотидов матричной нити ДНК образует гибридную спираль с растущим концом цепи РНК. По мере движения РНК-полимеразы по матрице впереди нее происходит расплетание, а позади - восстановление двойной спирали ДНК. Одновременно освобождается очередное звено растущей цепи РНК из комплекса с матрицей и РНК-полимеразой. Эти перемещения должны сопровождаться относительным вращением РНК-полимеразы и ДНК. Трудно себе представить, как это может происходить в клетке, особенно при транскрипции хроматина. Поэтому не исключено, что для предотвращения такого вращения двигающуюся по ДНК РНК-полимеразу сопровождают топоизомеразы.
Элонгация осуществляется с помощью основных элонгирующих факторов, необходимых, чтобы процесс не останавливался преждевременно [ Nikolov ea 1997 ]. В последнее время появились данные, показывающие, что регуляторные факторы также могут регулировать элонгацию. РНК-полимераза в процессе элонгации делает паузы на определенных позициях гена. Особенно четко это видно при низких концентрациях субстратов. В некоторых участках матрицы длительные задержки в продвижении РНК-полимеразы, т.н. паузы, наблюдаются даже при оптимальных концентрациях субстратов. Продолжительность этих пауз может контролироваться факторами элонгации.
Белок N-TEF дрозофилы индуцирует освобождение транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой II, и при его функционировании происходит расщепление ATP.
У дрожжей белковый фактор Reb-1 связывается с природными терминаторами транскрипции на ДНК, обеспечивая как остановку элонгирующей РНК-полимеразы I на этих терминаторах, так и последующее освобождение РНК из транскрипционных комплексов. Удаление в результате делеции из рибосомной транскрипционной единицы Reb-1-связывающего сайта нарушает правильное образование 3'-концов рРНК in vivo.
Мышиный фактор TTF-1, который также является ДНК- связывающим белком, необходим для правильной терминации транскрипции РНК-полимеразой I в клетках этих животных. У них же обнаружен LА-белок, специфически взаимодействующий с РНК, функционирование которого требуется для образования транскриптов полной длины под действием РНК-полимеразы III, что происходит в результате освобождения РНК из транскрипционных комплексов и реинициации транскрипции.
Терминация транскрипции у эукариот - это пока довольно плохо изученный процесс. Ясно, однако, что он происходит за пределами собственно гена в области спейсера ( Falck-Pederson ea, 1985 ). Эксперименты с разными искусственными конструкциями показывают, что для терминации транскрипции нужно существование в геноме зоны терминации и обязательно расположенного перед нею сайта полиаденилирования. Если последний убрать, то транскрипция идет за зону терминации. В то же время зону терминации можно удалять и приближать к сайту полиаденилирования, и терминация все равно будет происходить в ее пределах.
Нуклеотидные последовательности зон терминации, прилежащих к разным генам, содержат ряд гомологичных областей, однако в настоящий момент вопрос о природе сигналов терминации остается открытым. Для этого необходимы опыты по мутагенезу в зонах терминации.
Транскрипции регуляция: промоторная
Изменение характера экспрессии генов можно наблюдать в бесклеточных системах, компонентами которых являются собственно ген, энхансер и специфические регуляторные белки. Оказывается, что энхансер в зависимости от добавляемого белкового фактора может начать вести себя и как негативно действующий "глушитель" (англ. silencer) экспрессии гена. Негативное действие такого элемента, проявляется при связывании с тканеспецифичным трансдействующим белковым фактором. Негативное действие сайленсеров, как и в случае энхансеров, не зависит от положения и ориентации относительно сайта инициации транскрипции.
По мере исследования регуляторных элементов генома эукариот оказалось, что не удается провести строгих функциональных различий между энхансерами и элементами промотора. Прежде всего ориентация таких активных элементов промотора как GC-мотивы, может быть любой относительно направления транскрипции гена. Более того, промоторные элементы генов металлотионеина и генов теплового шока, отделенные от TATA-последовательности, определяющей сайт инициации транскрипции, также сохраняют специфические регуляторные свойства вне зависимости от ориентации.
Промоторный участок гена металлотионеина, включающий ряд регуляторных мотивов, способен сильно стимулировать экспрессию гена бета-глобина и в том случае, если промотор расположить на 3'-фланге относительно направления транскрипции, причем на значительном расстоянии от бета-глобина.