Фармацевтикалық және медициналық өнеркәсіптеріндегі биотехнология

 

мұндағы:  μ_макс - максимальді меншікті өсу жылдамдығы;

   S – субстрат концентрациясы;

   K_S – қаныққан констант.

Өсудің меншікті жылдамдығы өнімдерге байланысты болады, жасушалардан зат  алмасу процесі кезінде ортаға бөлінеді. Жасушалардың өсуін ингибитолар  тежейтінін  ескертетін  теңдеу Моно – Иерусалим теңдеуі ретінде белгілі, келесідей түрде келтіріледі:

 

мұндағы: Р – жасушалар  өсуін ингибирлейтін өнім концентрациясы;

                  К_Р – ингибирлеуші констант;  өнім концентрациясына саны тең, бұл кезде өсудің меншікті жылдамдығы екі есеге төмендейді.

 Популяция экспоненциальды өсу теңдеуі:

Х=X_o l ^{μ макс τ}

мұндағы: Х_о – биомасса саны немесе уақыттың бастапқы кезеңіндегі жасушалар саны,

е – табиғи  логарифмнің  негізі.

Бұл теңдеуді логорифмдеуде  аламыз:

 

ln_x = ln_xо+ μ_макс τ

Демек, биомасса мөлшерінің логорифмі және жасушаның саны тұрақты  жылдамдықпен жоғарылайды. Сондықтан  бұл фаза логарифмдік фаза деп  аталады.

Микроорганизмдердің қарқынды өсуінің және қоректік ортадағы микроорганизмдердің  көбеюінің нәтижесінде дәл осы қарқындылық пен қоректік заттар жұмсалады да, өмір сүруші микроорганизмдердің өнімдері жиналады. Сонымен қатар бос кеңістік шектеледі, жасушалар өсу барысында бір–біріне бөгет жасайды, жасушаларға қоректік заттардың келуі және метаболиттердің бөлінуі нашарлайды. Өсу жылдамдығы төмендейді, жасушалардың бөлінуі қысқарып, содан соң өсудің келесі фазасы басталады.

IV фаза – баяу  өсу фазасы немесе өсу жылдамдығының төмендеуі. Бұл фазаның, экспоненциалды фазаға қарағанда жасушалар бітекті болмайды, себебі қолайсыз факторлардың әсерінен қоректік зат концентрациясы төмендейді,  зат алмасуда өнімнің жиналуы өседі. Мұның барлығы культураның өсу процесінің баяулануына және тоқтап қалуына әкеліп

 

соқтырады, сонымен қатар  олардың жойылуы және жасушаларда лизес бөлігінің тууы мүмкін.

V фаза – стационарлы фаза деп аталады. Стационарлы фазада  жаңадан пайда болған жасушалар мен қырылған жасушалар  саны теңеледі. Сондықтан тірі жасушалар  саны  біраз уақыт тұрақты болып қала береді. Көбею кезінде  түзілген өнімдер  микробтар тіршілігіне  нұсқан келтіре бастайды. Бұл фаза бірнеше сағаттан бірнеше күнге дейін созылады. Стационарлы фазада биомасса культурасының өсуі тоқтайды:

            

Бірақ ескере кету керек, бірнеше уақыт бойы бұл фазада биомассаның біршама өсуі болады, бұл стационарлы фазадағы жеке жасушалардың көбеюінің жалғасатынын түсіндіреді. Бірақ көбею процесі жасушалардың жойылу процесімен  және олардың кейбіреуінің автолизімен теңеседі. Биомасса өсуі стационарлы фазаға жеткенде культура биомассасының көп мөлшері және жасушаның максимал саны жиналады. Бұл максимал мөлшерін өнімнің жемісі немесе шығымы деп атайды. Іс жүзінде сыртқы көзқарасқа қызығушылық тудырады, бұл экономикалық коэффициент деп аталады. Бұл көрсеткішті пайда болған микроорганизмдердің  массасы мен жұмсалған субстрат мөлшерімен салыстыруға болады :          

         у = х/S

Стационарлы фаза үшін жасуша популяциясының гетерогенді жоғарылауы сипатталған, онда бірқатар жеке көбейетін  жасушамен бірге әлі тірі жасушалар да болады, бірақ олардың әрмен қарай өсу қабілеті жоғалып, өлі жасуша лизистеледі.

VI фаза – қырылу  фазасы немесе жойылу фазасы. Қырылу  фазасында пайда болған жасушалар  санынан өлген жасушалар саны басым болады. Қоректік ортаның  физикалық-химиялық қасиеті мүлде өзгеріп, микроорганизмдер тіршілігіне зиянды жағдайға көшеді. Жасушалардың қырылу жылдамдығы арта түседі. Ол өлген жасушалардың саны қайта пайда болған жасушалар санынан көп болған кезден бастап басталады. Бұл фазада жасушалардың өмір сүру жағдайлары қолайсыз, ал жасушалардың артық  заттарының қоры таусылады. Микроорганизмдерді периодты әдіспен өсіру көптеген өндірістерде, егіс материалын алу сатысында қолданады, оның басты сатысы – ферментация, көптеген өндірістер үздіксіз немесе периодты әдіске  байланысты емес. Үздіксіз культивирлеудің артықшылығына қарамастан, көптеген өндірістер периодты әдісті қолданады, ол микроорганизмдер продуценттерінің қасиеттерінің қиыншылығына байланысты. 

 

Микроорганизмдерді  үздіксіз культивирлеу

Периодты культивилеуде микроорганизмдердің максималды өсу қабілеті толық қолданылмайды. Өмір сүрудің ең активті кезеңі – логарифмдік фаза - өндірістік циклдің  азырақ бөлігін алады, ал уақыттың көп бөлігі лаг фазаға кетеді және өсудің жәймен өсетін кезеңіне өтеді.

Периодты культивирлеу кезінде жасушалар барлық уақыт бойы ауыспалы жағдайда болады. Алдымен қоректік ортаға дер кезінде көп мөлшерде қоректік заттарды енгізсе, жасуша өсуінің ингибирленуі сонда өмір сүруші микроорганизм өнімнің жиналуы және қоректенудің жетіспеуі басталады. Егер қоректік ортаға бірден мол  мөлшерде қоректік зат қосса, онда культураның өсуінің ингибирленуі болады, демек микроорганизмдердің катаболиттік репрессиясы деп аталады. Қоректік затты жаймен қосудың арқасында микроорганизм өсуінің ингибирленуінен құтылуға болады.  Осы мөлшердегі қоректік заттарды енгізу процесі кезінде микроорганизмдердің өсуінің ингибирлеруін болдырмауға болады. Бұл әдіс субстраты майдалап мөлшерлеумен  микроорганизмдерді культивирлеу деп аталады.

Культивирлеу барысында қоректену көздерін қосу кезінде қоректік ортаның көлемі өзгереді. Орта көлемін қалыпты және ортадағы өмір сүруші микроорганизм өнімдерінің концентрациясын төмендетіп ұстап тұру үшін, культуральды сұйықтықтың бөлігін белглі бір уақыт аралығында аппараттан алып тастауға болады. Мұндай периодты культивирлеу процесті «көлемді-мөлшерлеуіш» деп атайды. Мұның алдыңғы әдістен айырмашылығы,  культураның бөлігі периодты түрде жаңа ортаға түскен сайын алынып тасталынып отырады. Берілген жағдайда процестердің негізгі параметрлері – көлемі,  араластыру жылдамдығы, өсудің меншікті жылдамдығы – тұрақты болып есептелмейді культура квазистационарлы (мнимостационарлы) жағдайда болады.

 Субстратты майдалап  мөлшерлеуде  периодты культивирлеудің   тағы бір әдісі бұл – диализдеуші мембрана арқылы лимиттеуші субстраттың келуін бақылаушы процесс. Егер аппаратқа мембрананы орнатқанда, сол арқылы тек белгілі бір заттар ғана енеді, мембранадан бөлінген, ерітіндіден еріген зат диффузиясы арқасында ортадағы оның концентрациясы тұрақты ұсталынып тұрады. Бұл әдісті шектелген субстрат продуцентінің өсуі үшін қолдануға болады немесе биомассаны концентрлеу үшін, субстратты майдалап мөлшерлеуіш периодты культивирлеу үшін, даму фазасынан популяцияға келу уақытының көбейтуіне мүмкіндік береді. Бірақ жасушалардың физиологиялық күйін тұрақтандыруды уақытқа байланыстырмай, осы әдіспен жүзеге асыру мүмкін емес.

 

Микроорганизмдерді  үздіксіз культивирлеу жағдайлары

Үздіксіз культивирлеу ферментерге белгілі мөлшерде және сапалы қатынаста қоректік заттарды үздіксіз  беріп отыру болып табылады, ол микроорганизмдерді ұстап тұру  үшін экспоненциалды фазасында дамиды. Мұндай жағдайларда қозғалмалы тепе – тең күйге жеткізеді, бұл кезде жасушалардың үздксіз және бірдей жылдамдықпен көбеюі, қоректік заттармен келу жылдамдығымен сәйкес болады. Культивирленетін жасушаларды қоректік заттар мен үнемі қамтамасыздандырылуына қарамастан культуралды сұйықтықта іс жүзінде олар мүлдем жоқ, демек ағып өтетін сұйықтықта жоқ деген сөз. Үздіксіз культивирлеудің аса маңызды сипаттамасының бірі ол

араластыру жылдамдығы, демек ферментердегі қоректік ортаның  алмасу жылдамдығы. Егер культиватордың көлемін (V/л), ал ортаға келу жылдамдығы – ағын жылдамдығы F(л/сағ) деп белгілесек, онда араластыру жылдамдығы  Д(сағ^-1) тең болады:             

                        Д=F/V

Микроорганизмдердің өсуінің  меншікті жылдамдығы:

                          

Осыдан культивирлеу кезіндегі микроорганизмдердің  тез өсуі мынаған тең:      
                       

Үздіксіз культивирлеу жағдайында биомассаның тез арада  өсуі μ_х, оның орта мен Д_х, кетуімен қамтамасыздандырылады,

 

   яғни   μх  – Д_х> 0  немесе  (μ-Д)х>0

       Осыдан : μ=D  Бұл теңдеу микроорганизмдерді үздіксіз культивирлеу кезінде орныққан тепе-теңдікті ұстап тұрудың негізгі шарты. Бұл кезде барлық технологиялық және физиологиялық көрсеткіштер тұрақты болып сақталады. Технологиялық көрсеткіштерге культуральды сұйықтық компоненттерінің концентрациясы, ал физиологиялық – жасушаның өсу жылдамдығы және олардың құрылымдық -биохимиялық ерекшеліктері жатады.

2  сурет.  Периодты процестен үздіксіз процеске ауысқанда

жасуша  концентрациясының  ауытқуын сипаттаушы қисық.

І-активтелу сатысы; ІІ-стабилизациялау сатысы.

 

  Ескере кету керек, үздіксіз культивирлеу кезіндегі берік күйдегі жағдай бірден пайда болмайды.  Бөлу процесі басында байқалады, сол кезде биомассаның концентрациясы тепе-теңдік күйге жақын болады, бұл графикалық қисық толқын сызығымен сипатталады, олар жаймен түзу

 

сызыққа өтеді  (6-сурет).  Кейде бұл кезеңді екі сатыға бөледі: І активтелу  және ІІ стабилизациялау сатысы .

Үздіксіз культивирлеу процесіндегі микроорганизмдердің  өздігінен  реттелу  қабілеті

Үздіксіз культивирлеуде араластыру жылдамдығы меншікті өсу жылдамдығы мен тепе-теңдік жағдайдағы режимді орнатуды  бақылау және қоректік ортаның ағып келуін ұстап тұру  қажет. Бірақ үздіксіз культивирлеу жүйесіндегі микроорганизмдер өздігінен реттеуші қабілетке ие.

Егер де қабылданған  режим араластыру жылдамдығы есебінен бұзылса, онда жүйеде қандай өзгерістер тууы мүмкін? Қоспаның құрамы немесе қоректік ортаның берілу жылдамдығы өзгерген кезде жүйе тепе-теңдік күйден шығып, олардың параметрлерінде бір-бірімен байланысты өзгерістер пайда болады.

Араластыру жылдамдығы микроорганизмдердің меншікті өсу жылдамдығынан төмен деп қарастырсақ, демек D<μ. Мұндағы μ–D      айырмашылығы оң болады. Осыған байланысты ферментатерге қоректік ортаның түсуі көбейсе, биомассаның  концентрациясы Х жоғарылай бастайды, ол қоректік заттардың жоғарылауына және зат алмасу өнімнің жиналуына әкеліп соқтырады. Осының барлығы микроорганизмдердің өсу жылдамдығына кері әсерін тигізеді, оның өсу жылдамдығы төмендей бастайды. Осының салдарынан μ – D  0-ге ұмтылады, ал жүйе жаңа жылжымалы тепе-теңдіктің қалыптасуына ұмтылады. Бұл жағдайда биомасса концентрациясы алғашқысымен салыстырғанда жаңа өте жоғары деңгейде тұрақтанады .

Егер араластыру жылдамдығы меншікті өсу жылдамдығынан жоғарыласа (D>μ), онда μ – D айырмашылығы теріс мөлшерге ие болады және жүйедегі биомасса концентрациясы төмендей бастайды. Қоректік заттар аз жұмсалып, оның концентрациясы өседі, ол меншікті өсу жылдамдығына жағымды әсер етеді. Нәтижесінде жүйе жоғары концентрациялы қоректік заттарға және биомассаның төменгі концентрациясына сәйкес жаңа қалыптасқан режимге келеді.

Олай болса, бастапқы мәнді (ағымының жылдамдығы немесе қоректік орта құрамы) өзгерте отырып, жүйеге ауысады. Жасуша - орта жүйені бір қозғалмалы тепе – теңдік күйден басқа бір  күйге ауыстыруға болады, осыдан барып үздіксіз процестер өздігінен ретелу қабілетіне ие болады, ол максималды меншікті өсу жылдамдығын қамтамассыз етеді. Араластыру жылдамдығын максимальды меншікті өсу жылдамдығынан жоғарылатқанда, (D>μ макс), онда белгілі бір уақыттан кейін микроорганизм ферментатерден шығарылып жуылады. Үздіксіз культивирлеудің маңызды көрсеткішінің бірі - өнімділігі болып табылады, ол биомасса концентрациясы араластыру жылдамдығының жүруімен анықталады :                                    П=D_Х

Араластыру жылдамдығы максимальді болғанда, өнімділігі  максимум жағдайға жетеді.

 

 

Үздіксіз культивирлеу жүйесінің классификациясы

Қазіргі кезде микроорганизмдерді үздіксіз культивирлеу әдісі тереңірек  теориялық негізі бар және іс-жүзінде  кеңірек қолданылады. Үздіксіз культивирлеу процестерін қолдану қазіргі уақытта жеткілікті және оларды классификациялауға болады. Үздіксіз культивирлеуді классификациялағанда жұмыс істеу  принципіне қарай классификациялаған жөн.

Үздіксіз культивирлеу жүйесін ашық және тұйық деп ажыратуға  болады. Ашық жүйедегі жоғары жылдамдықпен пайда болған жаңа жасушалар барлық уақытта ағымдағы ортада  жуылады, бұл жағдайда олардың тұрақты концентрациялары оңай  жетіледі.           Тұйық жүйеде жасушалар қандайда бір уақытта жүйеде тоқтап қалып, олардың саны ұлғаяды. Бұл жағдайда шектелген факторлардың бәрі басқасына  ауыстырылады, соңында жасушаның үлкен бөлігі өледі және   мұндай жүйе динамикалық тепе – теңдік жағдайына жете алмайды.   Іс-жүзінде  процесс периодты ұзартылған түрде жүреді. Сол себепті тұйық культивирлеу жүйесін, шектеусіз уақытта функциялауға қабілетті барды үздіксіз ағым деп қарастыруға болмайды. Жұмыс жасау принципін техникалық өзгерту арқылы ашық жүйені тұйық жүйеге ауыстыруға болады.          Ашық жүйе мен тұйық жүйелердің басты айырмашылығы – ашық жүйе бекітілген динамикалық жүйеде жүреді, ал жабық демек, тұйық жүйе мұндай жағдайға  жете алмайды.           Үздіксіз процесс гомогенді - үздіксіз және гетерогенді - үздіксіз болып бөлінеді. Гомогенді–үздіксіз процесте ферментерде қарқынды араластырудың арқасында барлық параметрлері (қоректік заттардың концентрациясы, микроорганизмдердің өсу жылдамдығы)  барлық уақытта тұрақты.   Гетерогенді – үздіксіз процесте бірнеше ферментер батареяға жалғасады, және әрқайсысы культивирлеу жағдайын тұрақты ұстап тұра алады,бірақ басқа  ферментерден айырмашылығы болады. Мұндай әдісте жасушалардың өсуі үшін үнемі тұрақты жағдайларды қамтамасыз ете алмайды

Ашық бірсатылы гомогенді  – үздіксіз жүйелер. Ашық бірсатылы  гамогенді - үздіксіз жүйе деген бір  ферментерден барлық уақытта қоректік орта берілетін және культуралды сұйықтық шығарылатын жүйені айтады. Қарқынды араластырудың арқасында ортаның құрамы аппараттың кез келген жерінде гомогенді ұстап тұрады, осының арқасында микробтық жасушалар біркелкі физиологиялық күйде келіп түседі.

         Ортаны қарқынды араластырып  ортаның біркелкі болуын қамтамасыз  ететін негізгі аппарат ферментатер  болып табылады (7 сурет). Жаңадан  дайындалған қоректі орта белгілі  бір және тұрақты жылдамдықпен  ферменторға келіп түседі. Культуралды сұйықтық және микроорганизмдерде өскен жасушалардың қосқан санымен, сондай жылдамдық пен ферментерден шығарылады. Жасушаның қоректік заттың және метоболизм өнімінің жалпы барлық компоненттердің концентрациясы ферменторда бірдей болады.