Ферменты как биологические катализаторы

 

 

 

Факультет Биологии

Кафедра Биотехнологии

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Реферат

по клеточной биотехнологии

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Алматы 2013

 

Содержание:

• Ферменты как биологические катализаторы
• Строение ферментов
• Специфичность ферментов
• Классификация
• Изоферменты
• Глубинный метод производства ферментов

 

 

Ферменты как биологические  катализаторы

 

Ферменты (энзимы) - это высокоспецифичные  белки, выполняющие функции биологических  катализаторов. Катализатор - это вещество, которое ускоряет химическую реакцию, но само в ходе этой реакции не расходуется.

Повышение среднего энергетического  уровня молекул (повышение температуры, давления и других параметров среды, которое используют на химических заводах  и фабриках) невозможно для живых  организмов, которые нормально функционируют  только при постоянных значениях  температуры, давления и других параметров. Невозможен и другой путь - уменьшение энергии активации путем снижения энергетического уровня реакции, поскольку  эта величина является постоянной характеристикой  данной реакции. Поэтому, только явление катализа (применение катализаторов) может обеспечить ускорение химических реакций в живых организмах.

Общие свойства катализаторов:

1. Катализаторы сами не вызывают химическую реакцию, а только ускоряют реакцию, которая протекает и без них.

2. Не влияют на энергетический  итог реакции.

3. В обратимых реакциях  катализаторы ускоряют как прямую, так и обратную реакцию, причем  в одинаковой степени, из чего следует, что катализаторы:

а) не влияют на направленность обратимой реакции, которая определяется только соотношением концентраций исходных веществ (субстратов) и конечных продуктов;

б) не влияют на положение равновесия обратимой реакции, а только ускоряют его достижение.

Ферменты обладают всеми  общими свойствами обычных катализаторов. Но, по сравнению с обычными катализаторами, все ферменты являются белками. Поэтому  они обладают особенностями, отличающими  их от обычных катализаторов. Эти  особенности ферментов, как биологических  катализаторов, иногда называют общими свойствами ферментов. К ним относятся:

1. Высокая эффективность  действия. Ферменты могут ускорять реакцию в 108 -1012 раз;

2. Высокая избирательность  ферментов к субстратам (субстратная  специфичность) и к типу катализируемой  реакции (специфичность действия);

3. Высокая чувствительность  ферментов к неспецифическим  физико-химическим факторам среды  - температуре, рН, ионной силе раствора и т.д.;

4. Высокая чувствительность  к химическим реагентам;

5. Высокая и избирательная  чувствительность к физико-химическим  воздействиям тех или иных  химических веществ, которые благодаря  этому могут взаимодействовать  с ферментом, улучшая или затрудняя  его работу.

 

Строение ферментов

 

Давно выяснено, что все ферменты являются белками и обладают всеми свойствами белков. Поэтому подобно белкам ферменты делятся на простые и сложные.

Простые ферменты состоят только из аминокислот  – например, пепсин , трипсин, лизоцим.

Сложные ферменты (холоферменты) имеют в своем составе белковую часть, состоящую из аминокислот – апофермент, и небелковую часть – кофактор. Кофактор, в свою очередь, может называться коферментом или простетической группой. Примером могут быть сукцинатдегидрогеназа (содержит ФАД), аминотрансферазы (содержат пиридоксальфосфат), пероксидаза (содержит гем). Для осуществления катализа необходим полноценный комплекс апобелка и кофактора, по отдельности катализ они осуществить не могут.

Как многие белки, ферменты могут быть мономерами, т.е. состоят из одной субъединицы, и полимерами, состоящими из нескольких субъединиц.

В составе  фермента выделяют области, выполняющие  различную функцию:

1. Активный  центр – комбинация аминокислотных  остатков (обычно 12-16), обеспечивающая  непосредственное связывание с  молекулой субстрата и осуществляющая  катализ. Аминокислотные радикалы  в активном центре могут находиться  в любом сочетании, при этом  рядом располагаются аминокислоты, значительно удаленные друг от  друга в линейной цепи.

У ферментов, имеющих в своем составе несколько  мономеров, может быть несколько  активных центров по числу субъединиц. Также две и более субъединицы  могут формировать один активный центр.

У сложных  ферментов в активном центре обязательно  расположены функциональные группы кофактора.

В свою очередь  в активном центре выделяют два участка:

- якорный (контактный, связывающий) – отвечает за связывание и ориентацию субстрата в активном центре,

- каталитический – непосредственно отвечает за осуществление реакции.

2. Аллостерический центр – центр регуляции активности фермента, который пространственно отделен от активного центра и имеется не у всех ферментов. Связывание с аллостерическим центром какой-либо молекулы (называемой активатором или ингибитором, а также эффектором, модулятором, регулятором) вызывает изменение конфигурации белка-фермента и, как следствие, скорости ферментативной реакции. В качестве такого регулятора может выступать продукт данной или одной из последующих реакций, субстрат реакции или иное вещество Аллостерические ферменты являются полимерными белками,  активный и регуляторный центры находятся в разных субъединицах.

 

Специфичность ферментов

 

Различают два главных  вида специфичности ферментов: субстратную  специфичность и специфичность  действия.

Субстратная специфичность - это способность фермента катализировать превращения только одного определенного субстрата или же группы сходных по строению субстратов. Определяется структурой адсорбционного участка активного центра фермента.

Различают 3 типа субстратной  специфичности:

1) Абсолютная субстратная специфичность - это способность фермента катализировать превращение только одного, строго определенного субстрата.

2) Относительная субстратная специфичность - способность фермента катализировать превращения нескольких, сходных по строению, субстратов.

3) Стереоспецифичность - способность фермента катализировать превращения определенных стереоизомеров.

Например, фермент оксидаза L-аминокислот способен окислять все  аминокислоты, но относящиеся только к L-ряду. Таким образом, этот фермент  обладает относительной субстратной  специфичностью и стереоспецифичностью одновременно.

Специфичность действия - это  способность фермента катализировать только определенный тип химической реакции.

В соответствии со специфичностью действия все ферменты делятся на 6 классов. Классы ферментов обозначаются латинскими цифрами. Название каждого  класса ферментов соответствует  этой цифре.

Классификация

 

I класс - Оксидоредуктазы.

К данному классу относятся  ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные  реакции. При окислении может  происходить либо отнятие водорода от окисляемого вещества, либо присоединение  кислорода к окисляемому веществу. В зависимости от способа окисления  различают следующие подклассы  оксидоредуктаз:

1) Дегидрогеназы. Катализируют реакции, при которых происходит отнятие водорода от окисляемого вещества. Пример:

2) Оксигеназы. Ферменты этого подкласса катализируют включение кислорода в окисляемое вещество.

a) Монооксигеназы - включают один атом кислорода в окисляемое вещество.

Пример:

 б)Диоксигеназы - включают 2 атома кислорода в окисляемое вещество. Часто это сопровождается разрывом циклической структуры. По месту разрыва связи (на рисунке обозначено стрелкой) присоединяются атомы кислорода.

Пример:

II класс - Трансферазы

Катализируют реакции  переноса химических групп с молекулы одного вещества на молекулу другого  вещества.

III класс - Гидролазы

Катализируют реакции  разрушения химических связей с участием воды.

IV класс - Лиазы

Катализируют реакции  разрушения химических связей без участия  воды.

V класс - Изомеразы

Катализируют реакции  изомерных превращений.

VI класс - Лигазы

Катализируют реакции  синтеза.

 

Изоферменты

 

Изоферменты – это множественные  формы одного и того же фермента. Изоферменты катализируют одну и  ту же реакцию, но отличаются по аминокислотному  составу и некоторым физико-химическим свойствам (молекулярной массе, электрофоретической  подвижности и др.). Например, фермент  лактатдегидрогеназа (ЛДГ) существует в пяти формах: ЛДГ, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5.

Каждая ткань имеет  определенный изоферментный спектр ЛДГ: в сердечной мышце – ЛДГ1,2; в печени, скелетных мышцах – ЛДГ4,5.

 Какова целесообразность  синтеза фермента в нескольких  молекулярных формах? В тканях  с преимущественно аэробным обменом  веществ (сердечная мышца), преобладают  формы ЛДГ1,2, которые обеспечивают ткани большим количеством энергии. В тканях с преимущественно анаэробным обменом веществ (печень, скелетные мышцы) преобладают ЛДГ4,5, что приводит к образованию молочной кислоты и двух молекул АТФ.

 Определение уровня  активности изоферментов в сыворотке  крови имеет важное значение  в диагностике заболеваний. например, повышение активности ЛДГ1,2 наблюдается при инфаркте миокарда; ЛДГ4,5 – при заболеваниях печени (гепатит, цирроз).

 

Ферментные препараты  широко используют в медицине. Ферменты в медицинской практике находят  применение в качестве диагностических (энзимодиагностика) и терапевтических (энзимотерапия) средств.

 Ферменты используют в качестве специфических реактивов для определения ряда веществ. Так, глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови. Фермент уреазу используют для определения содержания количества мочевины в крови и моче. С помощью различных дегидрогеназ обнаруживают соответствующие субстраты, например пируват, лактат, этиловый спирт и др.

 Энзимодиагностика - заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:

- при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;

- количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;

- активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени И отличается от нормальных значений;

- ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);

- существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.

Использование ферментов  в качестве терапевтических средств  имеет много ограничений вследствие их высокой иммуногениости. Тем не менее энзимотерапию активно развивают в следующих направлениях:

- заместительная терапия - использование ферментов в случае их недостаточности;

- элементы комплексной терапии - применение ферментов в сочетании с другой терапией.

 Заместительная энзимотерапия эффективна при желудочно-кишечных заболеваниях, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков. Например, пепсин используют при ахилии, гипо- и анацидных гастритах. Дефицит панкреатических ферментов также в значительной степени может быть компенсирован приёмом внутрь препаратов, содержащих основные ферменты поджелудочной железы (фестал, энзистал, мезим-форте и др.).

 В качестве дополнительных  терапевтических средств ферменты  используют при ряде заболеваний.  Протеолитические ферменты (трипсин,  химотрипсин) применяют при местном  воздействии для обработки гнойных  ран с целью расщепления белков  погибших клеток, для удаления  сгустков крови или вязких  секретов при воспалительных  заболеваниях дыхательных путей.  Ферментные препараты рибонуклеазу и дезоксирибонуклеазу используют в качестве противовирусных препаратов при лечении аденовирусных конъюнктивитов, герпетических кератитов.

 Ферментные препараты  стали широко применять при  тромбозах и тромбоэмболиях. С  этой целью используют препараты  фибринолизина, стрептолиазы, стрептодеказы, урокиназы.

 

Глубинный метод производства ферментов

 

В этом случае микроорганизмы выращиваются в жидкой питательной  среде. Технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается автоматизации и механизации. Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтрата перед его выделением.

При глубинном культивировании  продуцентов ферментов выделяют, как и в любом биотехнологическом процессе, 5 этапов.

1. Приготовление питательных  сред зависит от состава компонентов.

Некоторые предварительно измельчают, отваривают или гидролитически расщепляют. Готовые к растворению компоненты подают при постоянном помешивании в емкость для приготовления среды в определенной последовательности. Стерилизацию среды проводят либо путем микрофильтрации с помощью полупроницаемых мембран, либо при помощи высоких температур. Время обработки в этом случае зависит как от интенсивности фактора, так и от уровня обсемененности объекта. Стерилизуются также все коммуникации и аппараты. Воздух очищается до и после аэрирования. До - потому что содержит частицы пыли органической и неорганической природы, после - так как несет клетки продуцента.