Шпаргалка по дисциплине «Микробиология»

2.Мезофилы- растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум- при 37 градусах С).

3.Термофилы- растут при  температурах выше плюс 45 градусов.

Краткая характеристика питательных сред.

По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды.

Агар- полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны- продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты- мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.

По назначению среды разделяют на ряд групп:

- универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных  микроорганизмов (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА);

- специальные- среды для  микроорганизмов, не растущих  на универсальных средах (среда  Мак- Коя на туляремию, среда  Левенштейна- Иенсена для возбудителя туберкулеза);

- дифференциально- диагностические- для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам ( среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);

- селективные (элективные)- для выделения определенных видов  микроорганизмов и подавления  роста сопутствующих- пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.

По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.

 

 

 

 

 

 

25. Методы культивирования  анаэробов.

Для культивирования анаэробных микроорганизмов необходимо создание бескислородных условий, достигаемое различными методами.

 
Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах  — анаэростатах. Иногда воздух в них заменяют каким-либо другим газом, например СО2. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика сахарного агара или среды Вильсона — Блера, налитых в пробирки в расплавленном состоянии и остуженных до 43°С. По методу Вейона — Виньяля расплавленный и остуженный агар с посевным материалом набирают в стеклянные трубочки, которые запаивают с двух концов.

 
Химические методы заключаются в  том, что при культивировании  исследуемого материала на плотных  средах в эксикатор помещают химические вещества, например пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с  поглощением кислорода. В жидкие питательные среды можно добавлять  различные редуцирующие вещества: аскорбиновую или тиогликолевую кислоту.

 
Биологический метод основан на одновременном культивировании  аэробов и анаэробов на плотных  питательных средах в чашках Петри, герметически закупоренных. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, а затем начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине. Наиболее удобна для культивирования анаэробов специальная среда Китта — Тароцци. В нее входят сахарный МПБ, который наливают в пробирки в количестве 10—12 мл, и кусочки вареных паренхиматозных органов. Перед употреблением среду Китта ,— Тароцци кипятят на водяной бане для удаления растворенного в ней кислорода. Среду заливают сверху стерильным вазелиновым маслом. Заметный рост анаэробов (помутнение) может наблюдаться через 48 ч и более в зависимости от количества посевного материала.

 
Рост изолированных колоний анаэробов  можно получить при рассеве исследуемого материала по поверхности кровяно-сахарного  агара, разлитого в чашки Петри. После посева чашки помещают в анаэростат. Исследуемый материал в убывающей концентрации можно засевать в высокий столбик агара. Образовавшиеся отдельные колонии анаэробов выделяют, распилив пробирку в месте роста. Колонии анаэробов для получения значительного количества биомассы отсевают затем на среду Китта — Тароцци. В качестве источника энергии для анаэробов используют глюкозу, добавление которой в питательную среду обязательно.

 

26. Методы выделения  чистых культур бактерий. 

Выделение отдельных видов бактерий (чистой культуры) из исследуемого материала, содержащего, как правило, смесь различных микроорганизмов, является одним из этапов любого бактериологического исследования. Чистой культурой микробов получают из изолированной микробной колонии. 
При выделении чистой культуры из крови (гемокультуры) ее предварительно «подращивают» в жидкой среде: 10-15 мл стерильно взятой крови засевают в 100-150 мл жидкой среды. Соотношение засеваемой крови и питательной среды 1:10 не случайно - так достигается разведение крови (неразведенная кровь губительно действует на микроорганизмы).

Этапы выделения чистой культуры бактерий 
I этап (нативный материал) 
Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре). 
Посев на плотные питательные среды (получение колоний). 
II этап (изолированные колонии) 
Изучение колоний (культуральные свойства бактерий). 
Микроскопическое изучение микробов в окрашенном мазке  
(морфологические свойства бактерий). 
Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой культуры. 
III этап (чистая культура) 
Определение культуральных, морфологических, биохимических   
и других свойств  для идентификации культуры бактерий

Чистая культура - масса клеток, состоящая из микроорганизмов, принадлежащих одному виду и полученных как потомство одной клетки. Чистую культуру обычно получают путем пересева на стерильную питательную среду клеток, взятых из отдельно стоящей колонии бактерий. 

27. Питательные среды  и их классификация.

. Классификация питательных сред

Группа питательных сред	Жидкие	Плотные
Основные (простые)
Простые среды	Мясо-пептонный бульон (МПБ)	Мясо-пептонный агар (МПА)
Специальные (сложные)
А. Сложные специальные	Сахарный МПБ для стрептококков и др.	Сахарный МПА 5% кровяной агар и др.
Б. Элективные или избирательные (преимущественно  растет определенный вид микроорганизмов,  другие не растут или растут  плохо)	1% щелочная пептонная вода для холерного вибриона 10% желчный бульон для сальмонелл и др.	Желточно-солевой агар (ЖСА) для стафилококков Свернутая сыворотка для дифтерийной палочки Кровяной агар с ванкомицином для бактероидов и др.
В. Среды обогащения (всегда жидкие; используются для накопления микробов определенного вида. Рост сопутствующей микрофлоры подавляется ингибиторами)	Селенитовый бульон для дизентерийной палочки 10% желчный бульон для сальмонелл и др.	________
Г. Дифференциально-диагностические (применяются  для первичной дифференциации  бактерий преимущественно по  биохимическим свойствам, а также  для идентификации бактерий)	Среды Гисса (“пестрый ряд” для определения сахаролитической активности бактерий)	Среда Эндо Среда Левина Среда Плоскирева Среды Гиса (полужидкие) и др.
Д. Хромогенные (всегда плотные;  применяются для дифференциации бактерий по культуральным свойствам)	________	«УриселектТМ » и др.
Е. Транспортные (для доставки  исследуемого материала в лабораторию)	Среда Стюарта и др.	Среда Стюарта (полужидкая) и др.
Синтетические
	--------	Среда Сотона

Питательные среды классифицируют в зависимости от: 
 
v     химического состава и исходных компонентов; 
 
Ø      консистенции; 
 
·         целевого назначения. 
 
В зависимости от химического состава и исходных компонентов различают следующие типы питательных сред: 
 
- среды неопределенного химического состава (естественные или натуральные среды) – это среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющие сложный неопределенный химических состав: 
 
1)                          среды животного происхождения (исходные продукты – мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.) 
 
2)                          среды растительного происхождения (исходные продукты – соя, горох, картофель, морковь и т.д.) 
 
На естественных средах хорошо развиваются микроорганизмы, однако эти среды малопригодны для контролируемого изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов и диагностических исследований, поскольку они не позволяют учитывать потребности ряда компонентов среды, а с другой стороны определять вещества,  образующие  микроорганизмами. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. 
 
 «Полусинтетические» среды (гидролизатные), относящиеся к средам с неопределенным составом. В них, наряду с соединениями известной химической природы, входят вещества неопределенного состава. Их используют в микробиологической практике для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (продукты гидролиза мяса, молока, дрожжей, крови и др. белковых веществ). 
 
Среды известного химического состава (синтетические) – в их состав включают известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т.д.) в оптимальном количественном соотношении. Синтетические среды по составу бывают простыми или имеют относительно большой набор компонентов. Их используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных сред, например при получении диагностических аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том или ином конкретном химическом соединение. Кроме того, исследователи стремятся определить для каждого микроорганизма минимальные потребности в питательных веществах и, исходя из этого, создать минимальнуюсреду, содержащую лишь необходимы для его размножения  химические соединения. 
 
По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие. 
 
Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов. 
 
Полужидкие и плотные питательные среды. Используют для учёта количества бактерий, выделения их в виде «чистой» культуры и других целей.  Необходимую консистенцию среде придают добавлением различных уплотнителей - агар-агар или желатину. 
 
Агар-агар (малайское желе)- растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с ничтожным количеством азотистых веществ. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5-2%,полужидких –0,3-0,7%. 
 
Желатина – кислый азотистосодержащий продукт, добываемый при выварке костей и хрящей. Обычно в питательные среды вносят 10-20% желатины. Но ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину, что делает его неудобным для применения. 
 
По целевому назначению различают: 
 
А).Общеупотребительные (основные) среды. 
 
 Их применяют для культивирования относительно неприхотливых  микроорганизмов. 
 
Мясная вода: Получение – мясной фарш заливают водопроводной водой 1:2, кипятят 1ч., затем фильтруют, доливают водой до первоначального объема, разливают по емкостям, плотно закрывают и стерилизуют автоклавированием при 120^ОС 20 мин. 
 
Перевар Хоттингера  готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия нарезают, заливают кипящей водой 1:2, кипятят, охлаждают до 45^ОС, добавляют панкреатин, подщелачивают раствором карбоната натрия, встряхивают, добавляют хлороформ, закрывают и выдерживают в теплом месте 10 дней. 
 
Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления используют мясной бульон. К 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярной массой) для повышения калорийности среды и 5 г NaCI для создания осмотической активности. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды. Кипятят. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют автоклавированием при 120⁰С 20 мин. 
 
Мясо–пептонный агар (МПА): к 1 л МПБ добавляют 15-20 г мелко нарезанного агар-агара. Среду нагревают до растворения агара, устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na₂CO₃, фильтруют и через воронки разливают в пробирки, стерилизуют автоклавированием при120⁰ 20 мин. 
 
Мясо-пептонная желатина (МПЖ). К 1 литру МПБ добавляют желатин до конечной концентрации 10-20%, нагревают, устанавливают слабо-щелочную  pH, кипятят, фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром 3 дня или однократно  автоклавированием при 120⁰С при 1 атм.  течение  20 мин. 
 
Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25% агара, кипятят до его расплавления, устанавливают требуемую pH, фильтруют в горячем виде и стерилизуют  автоклавированием. 
 
Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водой 1:5 (1:8), добавляют 0,5% NaСI, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают pH, кипятят 150-20 мин, фильтруют, разливают по емкостям и стерилизуют автоклавированием при 120⁰ 20 мин. 
 
Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хоттингера 2% агар-агара. 
 
Питательный бульон содержит: триптический гидролизат кильки –10,05, NaCI- 4,95. 15 г порошка этого бульона растворяют а 1 л дист. Воды, кипятят 2 мин, фильтруют, разливают по емкостям и стерилизуют а автоклаве при 120⁰С 20 мин (Ph 7,3). 
 
Питательный агар содержит: ферментативный гидролизат кормовых дрожжей – 12 г, агар- 12,5 г; NaCI –5,5 г. Навеску 36 г полученного порошка растворяют в 1 л дист. Н₂О, кипятят 3 мин, фильтруют, стерилизуют автоклавированием при120⁰С 20 мин (pН 7,3). 
 
Б).Обогащенные среды. 
 
Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на обще-употребительных средах, поэтому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т.д. Такие среды получили название обогащенных. 
 
Сывороточный и кровяной агары: к расплавленному и охлажденному стерильному питательному агару добавляют дефибринированной крови или сыворотки крови (лошади, КРС, кролика). Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, пробирки и оставляют до застывания. 
 
Сывороточный и кровяной бульоны готовят аналогично. 
 
Растворы углеводов стерилизуют текучим паром или фильтрованием и добавляют в количестве 0,5- 1% к пит. среде. 
 
В).Специальные среды. 
 
Среды, разработанные с учетом специфических ростовых потребностей ряда бактерий. 
 
Среда Мак-Коя: куриные яйца обрабатывают спиртом, проводят через пламя горелки. Стерильно вскрывают, желтки отделяют от белков. К 60 частям желтков добавляют 40 ч физиологического раствора. Компоненты перемешивают и разливают в пробирки и помещают в наклонном положении в аппарат для свертывания сыворотки. Стерилизуют. 
 
Среда Терских состоит из фосфатной смеси Зеренсена и кроличьей сыворотки.  
 
Смесь Зеренсена: раствор А: гидрофосфат натрия, вода дист.; раствор Б: дигидрофосфат калия, вода дист. К 90 мл раствора А добавляют 10 мл раствора Б и доводят объем до 1000 мл, разливают по пробиркам, стерилизуют, а затем добавляют 6-8 капель стерильной инактивированной сыворотки кролика.

Г). Элективные (избирательные) среды

 
Предназначены для культивирования  определенных групп микроорганизмов, обеспечивающие преимущественное развитие одного вида или группы родственных  микроорганизмов и менее пригодные  или совсем не пригодные для развития других. Их применяют главным образом  для выделения микроорганизмов  из мест их естественного обитания и получения накопительных культур. Элективные среды чрезвычайно разнообразны по своему составу. По консистенции среды  данного типа могут быть плотными и жидкими. Жидкие среды называются средами обогащения или накопления, их применяют, когда ставят цель увеличить  количество искомого микроорганизма смешанной  популяции. Среды стерилизуют автоклавированием текучим паром или в автоклаве под давлением при 1 атм 12-30 мин. 
 
Молочно-солевой агар предназначен для избирательного культивирования стафилококков. 
 
Среда Шустовой предназначена для выделения сальмонелл 
 
Среды Раппопорта и Мюллера предназначены для культивирования сальмонелл. 
 
Среда Кауфмана – это среда обогащения для сальмонелл 
 
Казеиново - угольный агар (КУА) с пенициллином используют для культивирования бордетелл. 
 
Д). Дифференциально - диагностические среды. 
 
Предназначены для выявления ферментов у микроорганизмов. В состав этих сред входит основная питательная среда, обеспечивающая рост изучаемого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета которого судят о сдвиге pH среды в результате расщепления субстрата. 
 
Среды Гисса используют для изучения ферментативных свойств выделенных культур микроорганизмов. К 100мл дист. Воды добавляют 1% пептона, 0,5 г NaCI. Компоненты растворяют, фильтруют, устанавливают pH,добавляют один из углеводов субстратов, агар-агар, а затем индикатора Андрэдэ. Готовую среду разливают по 3мл в пробирки, стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. 
 
Среда Энда содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для дифференцировки бактерий, различающихся по способности расщеплять глюкозу. 
 
Среда Левина, по целевому назначению аналогична среде Эндо, но содержит другой индикатор. 
 
Агар Плоскирева предназначен для выделения сальмонелл, содержит лактозу в качестве субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. 
                    4. Культивирование грибов. 
 
Лучший рост грибов отмечен на средах с содержанием углеводов 1…4%. При первичной изоляции для подавления роста различных сопутствующих бактерий в питательные среды часто добавляют различные антибиотики. 
 
Агар Сабуро применяют для культивирования возбудителей дерматомикозов и кандидамикоза. 
 
Агар Чапека используют для культивирования грибов многих видов. 
 
Сусло-агар предназначен для культивирования возбудителей дерматомикозов и кандидомикоза. 
 
Агар Литмана пригоден для культивирования дерматофитов. 
 
Среда Ван-Итерсона предназначена для авыделения из кормов токсичных грибов, вызывающих стахиботриотоксикоз, дендродохитоксикоз и др. 
 
Среда Билай предназначена для получения макроконидий грибов. 
 
Культивирование на волосах по Ванбрейзегему применяют при выделении дерматофитов. Здоровые стерильные волосы прикрепляют коллодием к стеклянной трубочке. На середину волос наносят культуру гриба. Трубочку помещают в цилиндр, на дно которого для влажности наливают небольшое количество воды. Культивируют при 25⁰С 5-10 дней и более. 
 
Для выделения возбудителей гистоплазмоза, эпизоотического лимфангита применяют кровяной агар. 
          5. Вывод. 
 
Микроорганизмы культивируют на питательных средах.  К универсальным средствам относят мясо-пептонный агар и мясо-пептонный бульон. Первая характеристика изучаемого микроорганизма определяется способностью его роста на универсальных средах. На плотных питательных средах многие микроорганизмы образуют колонии. Для микроорганизмов, не растущих на обычных средах, используют специальные среды. Для выделения каких-либо определенных видов, отличающихся особенностями роста, применяют элективные среды.  
 
Правильный подбор и использование питательных сред обеспечивает успешное культивирование микробов  для накопления биомассы и её биотехнологическое использование для производства диагностических и вакцинных препаратов, определения и идентификации микробов в диагностической лаборатории и научных исследованиях. 

28. Требования, предъявляемые  к питательным средам.

Требования, предъявляемые  к питательным средам. Питательные  среды должны:

·       Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества.

·       Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.

·       Иметь достаточную влажность, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса.

·       Обладать изотоничностью.

·       Быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микробов.

Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные.

К первой группе относятся  мясо-пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроба.

К специальным питательным  средам относятся элективные (избирательные) и дифференциально-днагностическне.

Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строгом значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной.

 

29. Особенности биологии  вирусов.

Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в цитоплазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным способом размножения в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом.Форма вирионов может быть различной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ), в виде сперматозоида (многие бактериофаги). Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы.

Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, называемой капсидом.

Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены липопротеиновой оболочкой (суперкапсидом). Эта оболочка является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки.