Эколого-физиологические особенности доминирующей водоросли литоральной зоны озера Байкал U. zonata (Web. et Mohr) Kütz

 

 

2. Объекты и методы исследования

 

 

Сбор  полевого материала. Сбор макроводорослей  на глубине от 0 до 1,5-3 м осуществляли с использованием щипцов Рубцова. С  помощью скальпеля отделяли водорослей от камней. Пробу промывали через  капроновое сито, переносили в емкость  для хранения и фиксировали раствором  формалина до 4% конечной концентрации [45].

 

Для подготовки материала к проведению молекулярно-биологического анализа  пробы отбирали в бухте Большие  Коты, заливе Листвяничный, проливе  Малое море, на острове Большой  Ушканий, о-ве Ольхон. Образцы фиксировали  спиртом (96%), а также после удаления излишков воды помещали в полипропиленовые пробирки типа эппендорфа объемом 1,5 мл с силикагелем.

 

В работе используются данные изменений  химического состава воды в прибрежье  озера, предоставленные д.г.н., с.н.с. В.М. Домышевой и к.б.н. М. В. Сакирко, а также - неопубликованные данные о  динамике биомассы микроводорослей  в толще водыд.б.н. Н.А. Бондаренко.

 

Спектрофотометрический  анализ пигментов. В задачи данного  исследования входило изучение сезонной динамики фитомассы основной водоросли  урезовой зоны оз. Байкал Ulothrix zonata Kütz., содержания пигментов в её клетках и соотношения между этими показателями.

 

Спектрофотометрический  анализ пигментов U. zonata проходил на базе СИФБР СО РАН под руководством д.б.н. С.В. Осиповой. Для изучения концентраций пигментов материал отбирали в период открытой воды в западной части Южного Байкала в зал. Листвяничный и в бух. Большие Коты с июня по октябрь 2011 г. на расстоянии от 0,2 до 4 м от уреза воды с глубин от 0,3 до 0,5 м, во время ледостава - в заливе Листвяничный в феврале и марте 2012 г. под ледяным покровом, окаймляющим берег озера, - заберегом, с помощью щипцов Рубцова. В качестве руководства для отбора проб, их хранении, проведении анализа и обработке результатов использовался стандарт ГОСТ 17.1.4.02-90 «Вода. Методика спектрофотометрического определения хлорофилла а».

 

Перед проведением анализа предварительно водоросли очищали от загрязнений  и промывали дистиллированной водой. Излишки воды удаляли фильтровальной бумагой. Навески гомогенизировали в фарфоровых ступках с добавлением  ацетона (90%) и кварцевого песка в  течение 15 минут. Светорассеивающую  взвесь удаляли из экстракта центрифугированием на аппарате K26D (Германия) с ускорением 8000 оборотов/мин. в течение 15 минут. После центрифугирования экстракт доводили до объема фотометрической кюветы. При спектрофотометрировании использовали кюветы с рабочей длиной 1 см. Отсчеты оптических плотностей брали на шести длинах волн- 430, 480, 664, 647, 630 и 750 нм. Фотометрирование проводили дважды: до и после подкисления экстракта несколькими каплями приготовленного раствора соляной кислоты в ацетоне.

 

При обработке данных использовались стандартные  программные пакеты для персонального  компьютера.

 

Метод получения культур. Собранный в  природе живой материал служил источником получения лабораторной культуры водорослей. Культивирование проводили в  Центре коллективного пользования  «Пресноводный аквариумный комплекс» (ЦКП ПАК). Для этого использовали аквариальную установку. В аквариум, наполненный байкальской водой, помещали камни с обрастаниями. Температура  воды составляла £ 4 ° С. Температура  воздуха не превышала 7,5° С. В качестве источника освещения использовали люминесцентные лампы общего назначения. Небольшой фонтан моделировал волновое движение воды в аквариуме.

 

В условиях экспериментальной лаборатории  исследовали морфологические и  биологические особенности U. zonata с сентября 2010 года по июнь 2012 г. В ходе эксперимента дважды в неделю при микроскопировании наблюдали состояние культивируемой водоросли, фотографировали и делали замеры клеток.

 

Материал, полученный в условиях лаборатории, помещали в чашки Петри на северное окно лаборатории. Периодически (по мере подсыхания) в чашки добавляли  воду из исходного местообитания  и питательную среду Z-8 [133], имеющую активную реакцию (рН), как в исходной среде. Такие смешанные культуры служили источником живого материала.

 

Для выделения нитей U. zonata использовали пипеточный метод: при малых увеличениях светового микроскопа (× 10-20) с помощью стерильной пипетки Пастера с тонко оттянутым длинным концом отлавливали единичные клетки или нити. Водоросли, отловленные благодаря всасывающей силе капилляра, переносили из одной капли стерильного питательного раствора в другую, пока в капле не оставалась искомая водоросль с максимальным отсутствием посторонних видов, после чего чашки Петри выставляли на естественный рассеянный свет при комнатной температуре [12].

 

Обработка материала. Идентификацию, изучение особенностей морфологии водорослей проводили с  использованием светового микроскопа MEIJI TECHNO CO. LTD. при увеличениях ×100 и ×400. Результаты исследований документировали с использованием фотоаппарата Olympus C-3040 zoom (3.3Mgpxl) с фотонасадкой NY 2000S 01705.

 

Для определения биомассы использовали весы Iuchi Sefi (IB-200H) (Япония) и Adventurer Ohaus AR 2140 (Китай).

 

Для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) материал дегидратировали в  растворах этилового спирта возрастающей концентрации. Полное высушивание препаратов проводили при температуре 40º  С, после чего наносили на столики  для СЭМ и напыляли золотом (напыление  проводилось в приборе SCD-004 (Balzers). Столики с образцами исследовали в сканирующем электронном микроскопе FEI Company Quanta 200 в режиме высокого вакуума.

 

Экспресс-оценка влияния нефтезагрязнения. Оценку влияния  загрязнения водоема нефтепродуктами  на морфометрические показатели U. zonata проводили на основе сравнения популяций из р. Ангара, р. Олха и оз. Байкал. Во всех трех водоемах камни с обрастаниями брали на глубине примерно 0,5 м. При микроскопировании исследовали особенности морфологии клеток в талломах. Методика учета тератогенных особей заключалась в следующем: в 200 случайных полях зрений считали общее количество клеток и количество аномальных клеток, определяли их процентное соотношение.

 

Статистическая  обработка экспериментальных данных. При статистической обработке экспериментальных  выборок использовали стандартные  компьютерные программы ("МатЛаб", "Статистика", а также встроенные в "Excel" и графический редактор "Graf4Win"). Высчитывались среднее арифметическое значение и несмещённое среднеквадратичное отклонение, которые использовались как оценочные для матожидания и дисперсии генеральной совокупности [5]. Далее устанавливалось, какому из канонических распределений в наибольшей степени соответствует данная выборка. Доверительный интервал вычислялся, исходя из 95%-ого уровня доверия, по формуле

 

d = ± 1.96sn-1,

 

где sn-1 - несмещённое среднеквадратичное отклонение.

 

Ошибка  среднего значения находилась по формуле [5, стр. 36-37]:

 

 

 

 

 

где d0 - ошибка единичного измерения ,

 

dn - ошибка среднего серии измерений,

 

n - число измерений (объём выборки).

 

 

3. Результаты и обсуждение

 

 

.1 Особенности сезонного цикла  развития доминирующего вида  макроводорослей в прибрежной  зоне оз. Байкал U. Zonata

 

 

В ходе полевых наблюдений в зимний период в районе истока р. Ангара обнаружены нитчатые талломы водорослей ярко-зеленого цвета, растущие на небольших валунах  и камнях под ледяным покровом, окаймляющим берег озера, - заберегом. Ширина ледяного покрова в феврале  и марте составляет примерно 5 м, толщина льда- 30 см, глубина воды в прибрежной зоне, покрытой льдом - 0,5-0,7 м. И работах других исследователей зимняя популяция U. zonata в оз. Байкал была зафиксирована только в период ледостава, когда водная поверхность полностью покрывается льдом.

 

Выявлено, что обрастания каменистого прибрежья, развивающиеся под первичным  заберегом, в феврале и марте  представлены, главным образом, водорослями  родов Ulothrix, Spirogyra, Stigeoclonium, Didymosphenia, Stratonostoc., Cladophora.

 

В пробах, собранных с нижней поверхности  заберега, нити U. zonata всегда встречаются совместно с зеленой нитчатой водорослью Spirogyra sp. Elenk. Обилие последней в феврале значительнее. Талломы U. zonata, представленные преимущественно в виде фрагментов разной длины, состоящих из клеток с поясковидным хлоропластом, конечные клетки часто имеют закругленную внешнюю сторону (рис. 1). Эти морфологические особенности вида являются признаками интенсивного вегетативного деления, в результате которого, вероятно, пространственное распределение осуществляется более эффективно. Средние значения ширины клеток U. zonata в феврале составляли 21,2 км,длины - 10,5. Эпифитирующими на талломах улотрикса отмечены колонии Didymoshenia geminata (Lyngb.) M. Schmidt., Didymosphenia dentata (Dorogostaisky) Skv., Didymosphenia sp., видов родов Nitzschia Hass. и Navicula Bory.

 

В марте в некоторых подледных  участках отмечены многочисленные нити U. zonata, которые, поднимаясь от камней к нижней поверхности льда, образуют в толще воды своеобразные зеленые столбы длиной до 50-70 см и, порой, врастают в лед.

 

 

 

Рис. 1. U. zonata, вегетирующие в феврале под ледяным покровом, окаймляющим берег озера

 

 

Возможно, это происходит в результате избыточной численности водорослей на субстрате.Подобное явление К.И. Мейер [47] описывал для  летнего периода, объясняя это недостатком  аэрации. Проведенные нами наблюдения показали, что насыщение кислородом в период ледостава в дневное  время составляет 80%.

 

Формируя  ярко-бархатистый ковер, расстилающийся по каменистому дну и вдоль  внутреннего края заберега (рис. 2), не только подо льдом, U. zonata является доминантным видом в этой зоне озера, обилие талломов других нитчатых водорослей ему уступает.

 

 

 

Рис. 2. Обрастания U. zonata, формируемые на каменистом субстрате вдоль береговых ледовых наростов

 

 

При микроскопировании у U. zonata отмечен процесс массового спорообразования и выход зооспор (рис. 3).

 

 

 

Рис. 3.U. zonata, вегетирующий в марте под ледяным покровом, окаймляющим берег озера

 

 

Как следует из рисунка (рис. 5), средние  значения для ширины и длины клеток U. zonata в марте - 22 и 12 мкм соответственно. Эти значения так же, как и в феврале, ниже средних значений размеров клеток в летний период. Однако фитомасса, средняя величина которой в марте составляет 202,7 г/м2, близка к таковой в период, отмечаемый, как летний пик развития вида в Южном Байкале и равна 210, 6 г/м2. Это позволяет сделать предварительный вывод о том, что в зимнее время наблюдается второй пик развития U. zonata в мелководье литоральной зоны озера и выделить две популяции водоросли: зимнюю и летнюю.

 

Данные  о первичной структуры области  второго внутреннего транскрибируемого  спейсера кластера рибосомных генов (ITS2) указывают на существование 1% внутривидовой изменчивости между летней и зимней популяциями U. zonata в оз. Байкал (данные, полученные совместно с доктором Кристианом Боэдекером, Новая Зеландия, подготовлена к печати статья).

 

В апреле в зоне уреза воды, первой освобождающейся ото льда, на каменистом субстрате отмечаются обрастания U. zonata в виде молодых вегетативных нитей. Средние значения ширины клеток - 19,5 мкм, длины- 12,3 мкм. После освобождения прибрежья от заберегов, в талой воде на расстоянии 1 - 2,5 - 3 м еще можно наблюдать зимнюю популяцию, пик вегетации которой приходится на февраль - март. В этой зоне обрастания имеют темно-зеленый цвет, отчасти из-за присутствия большого количества песка, вероятно, попавшего в заросли водорослей при весеннем перемешивании воды в озере. Талломы U. zonata представляют собой короткие нити, разрушавшиеся в тех частях, где располагались многочисленные опорожнившиеся спорангии (рис. 4).

 

Не  смотря на то, что в некоторых  нитях все еще наблюдается  процесс спорообразования, выход  зооспор или их прорастание из материнской клетки, утолщение оболочек клеток, разрушение хлоропласта, обильное обрастание эпифитами и, в некоторых  случаях, формирование специфических  структур, похожих на пальмелевидное состояние, указывают на то, что водоросль  находится на стадии отмирания. Средние  значения размеров клеток водоросли  в этот период указаны на рисунке 5.

 

 

 

Рис. 4. U. zonata. Завершение вегетации зимней популяции

 

 

 

Рис. 5.Сезонная динамика морфометрических показателей вида.

 

 

В июне-июле наблюдается летний пик  развития вида [30]. Средние значенияширины клеток 46,8 и 36,3 мкм, длины- 25,8 и 29,4 мкм  соответственно. В летний максимум фитомассы зафиксировано активное вегетативное деление нитей, а также  процесс массового спорообразования (рис. 6).

 

 

 

Рис. 6. U. zonata в летний пик развития

 

 

В штилевую погоду вода в прибрежье  озера приобретает светло-зеленый  цвет. Это явление обусловлено  массовым выходом четырехжгутиковых  зооспор U. zonata. Их концентрация в толще воды представлена значением 1,77 х 105 кл/мл или 177 тыс. кл/мл. С помощью СЭМ указаны точные размеры клеток бесполого размножения U. zonata: длина спор равна 5,6 мкм (SD=0,7), ширина - 4,4 мкм (SD=0,8) (рис.7).

 

Возрастная  структура популяции не однородна  в течение всего периода вегетации. В июле и августе наблюдается  уменьшение средних значений ширины клеток, и, наоборот, увеличение длины (см. рис. 5). Это связано с тем, что  доля молодых особей в популяции  возрастает вследствие активного бесполого  размножения в июне.

 

 

Рис.7. Зооспоры U. zonata (СЭМ)

 

На  крупных валунах и скалах у  уреза воды нити U. zonata можно встретить до ноября [34]. Нами отмечено, что в условиях экспериментальной установки вегетация водорослей продолжается до декабря. В это время средние значения ширины клеток составляет 45,12мкм, длины- 29,08 мкм.

 

В ходе изучения особенностей сезонного  развития U. zonata нами не удалось проследить выход гамет и их копуляцию. Однако в осенний период, когда вегетация водорослей завершается, в прибрежье оз. Байкал и в культуре при микроскопировании отмечены многочисленные клетки округлой и дубинкообразной формы с утолщенной оболочкой и плотным, зернистым содержимым ярко-зеленого цвета, - одноклеточные спорофиты (Codiolum- стадия), формирующиеся в результате прорастания зиготы (рис.8). Это дает основание предположить, что споры, выходящие из спорофита, дают начало популяции U. zonata, вегетирующей в озере в период ледостава и дающей второй пик фитомассы в марте.