Стандартизация лекарственного растительного сырья, обладающего адаптогенным действием, на примере растений семейства аралиевые

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 2

Механизм адаптогенного действия препаратов на примере препаратов женьшеня

Общая адаптационная реакция (ОАР) начинается с раздражения периферических окончаний нервной системы и  возбуждения ретикулярной формации и центральной нервной системы. Затем через гипоталамус активируется секреторная функция передней доли гипофиза, за чем следует синтез и выброс АКТГ, стимулирующего секрецию кортикостероидов.

 Секреция кортикостероидов  зависит от уровня обменных  процессов в тканях, от токсичных  тканевых метаболитов, уменьшения  в тканях жизненно важных веществ  (энзимов, витаминов),  быстро расходуемых в борьбе со стрессом.

Гликозиды адаптогенов ингибируют секрецию коры надпочечников либо через  центральную нервную систему, либо где-то на пути между нею и надпочечниками, либо в периферических тканях. Но как  объяснить способность препаратов повышать физическую работоспособность? Как повышается устойчивость животных к дополнительному воздействию и нагрузкам? Почему гликозиды женьшеня, например, препятствуют развитию таких симптомов стресса, как общий катаболизм, изъязвления слизистых ЖКТ, гипотермии, которые наблюдаются при стрессе адреналэктомированных животных? Можно предположить, что изучаемые препараты таким образом регулируют метаболические процессы в тканях, что вмешательство адаптивных гормонов становится излишним, срабатывает обратная связь и гипофизадреналовая система функционирует с меньшим напряжением, создавая оптимальный уровень устойчивости организма.

Введение животным гликозидов женьшеня, также как и инсулина на фоне иммобилизации препятствовало образованию в-липопротеинового ингибитора. Известно, что во время стресса  ткани испытывают недостаток в глюкозе. Образование ингибитора метаболизма  глюкозы в здоровом организме, по-видимому, происходит всякий раз при стрессе. Выявлено, что переключение энергетического обмена на глюконеогенез при стрессе – положительная реакция. Энергетическое обеспечение функций организма на умеренное воздействие без включения ОАР – защита более высоко порядка (физиологическая адаптация). Защитное действие препаратов женьшеня частично объясняется их способностью снимать ингибирование в-липопротеином первых этапов утилизации глюкозы: захват глюкозы тканями и ее фосфорилирование. И все-таки функциональное состояние клеточных мембран и гексокиназной системы имеет существенное значение для неспецифической резистентности. Большое значение играет действие инсулярного аппарата,  а сам инсулин, подобно гликозидам, должен оказывать защитное действие при всякого рода стрессорных ситуациях. Это подтвердилось опытным путем. Например, спортсмены с высоким уровнем инсулярного аппарата более устойчивы к физическим нагрузкам.

Гонадотропное действие гликозидов женьшеня связано с регуляцией энергетического обеспечения уже активированных биосинтетических процессов. Оказывается, инсулин, применяемых в условиях эксперимента, как и гликозиды, ускорял половое созревание мышей. Это еще одно подтверждение сходства действия гликозидов и инсулина.

Гликозиды женьшеня обладают также антитоксическими свойствами, оказывают антигипнотическое действие при гексеналовом и мединаловом наркозе мышей.

При стрессорном воздействии поток энергии и пластического материала, обеспечивающий высокий уровень физиологической алаптации, не справляется с возросшим расходом энергии, влючается ОАР, и энергия мобилизуется из внутренних резервов организма за счет гликогенолиза и глюконеогенеза. При повреждении, превышающем УФА, общую неспецифическую защиту обеспечивают катехоламины и глюкокортикоиды. Т.е. если существуют два механизма неспецифической защиты, включающиеся поочередно, то при одновременном их использовании эффект должен суммироваться. При введении гидрокортизона с элеутерококком повышает устойчивость крыс к тяжелому стрессу в стадии истощения.

Изучаемые препараты также  оказывают влияние на и через  ЦНC. Например, не обнаружено защитное действие женьшеня на организм мыши при разрушении в условиях опыта центральной нервной системы.

Биологическое действие гликозидов осуществляется, по-видимому, непосредственно  в функционирующих органах. Роль ЦНС и эндокринных органов  в каждом случае различно. В основе механизма неспецифической защиты лежит в основном энергетическое обеспечение физиологической деятельности организма. [4]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 3

Стандартизация  ЛРС и препаратов женьшеня, аралии, заманихи

Наличие сапонинов в лекарственном  растительном сырье можно установить при помощи качественных реакций, которые проводят непосредственно с сырьем или с извлечением из него.

Качественные реакции  на сапонины основаны на их физических, химических и биологических свойствах. Для проведения качественных  реакций готовят  водный настой 1:10 при нагревании на водяной бане. После охлаждения настой фильтруют.

I. Реакции, основанные на физических свойствах.

          1) реакция на пенообразования: берут две пробирки, в одну добавляют 5 мл 0,1 моль/л HCl, в другую добавляют 5 мл 0,1 моль/л NaOH  и сильно встряхивают. Если образуется стойкая пена в обеих пробирках или в пробирке с кислотой – это говорит о кислых тритерпеновых сапонинах.

Стероидные сапонины дают обильную, стойкую пену в щелочной среде.

II. Химические методы. К ним относятся реакции осаждения сапонинов и цветные реакции.

1.Из водных растворов  сапонины  осаждаются гидроксидами  бария и магния, солями меди, ацетатом  свинца.

Причем тритерпеновые – осаждаются средним ацетатом свинца, а стероидные – основным.

2. Из спиртовых извлечений (или растворов) стероидные сапонины  и тритерпеновые сапонины выпадают в осадок при добавлении 1% спиртового раствора холестерина в виде холестеридов.

3. Стероидные сапонины, так  же как и сердечные гликозиды,  дают реакцию Либермана-Бухарда с уксусным ангидридом и кислотой концентрированной серной – образуется быстро переходящая окраска от розовой до зеленой и синей.

4.   Реакция Санье -  стероидные сапонины от тритерпеновых можно отличить по реакции с 1% раствором сурьмы треххлористой, концентрированной серной кислотой, содержащей уксусный ангидрид, если образуется желтое окрашивание.

Учитывая, что многие из перечисленных  химических реакций могут давать и другие соединения, проводят еще  и биологические испытания.

         III. Реакции, основанные на биологических свойствах сапонинов: реакция гемолиза с 2 %  взвесью эритроцитов в изотоническом растворе. Кровь становится прозрачной, ярко-красной. Для проведения этой реакции из растительно-го сырья готовят настой на изотоническом растворе.

Государственная фармакопея XI издания (вып.2) рекомендует использовать качественные реакции для подтверждения подлинности для трех видов сырья.

1.  Корни аралии маньчжурской.

Метанольное извлечение хроматографируют в тонком закрепленном слое силикагеля (на пластинках «Силуфол») в системе  растворителей хлороформ-метанол-вода (61:32:7). В качестве свидетелей используют раствор «Сапарала». Хроматограмму проявляют 20%  H2SO4 и нагревают в сушильном шкафу (1=105°С) в тече-ние 10 мин. Появляются 3 пятна вишневого цвета на уровне пятен аралозидов в «сапарале».

2.  Корни женьшеня.

а) Реакция с порошком корня женьшеня (на гликозиды). При  нанесении конц. H2SO4 на порошок корня женьшеня через 1-2 минуты появляется кирпично-красное окрашивание, переходящее в красно-фиолетовое, а затем - в фиолетовое.

б) Наличие панаксозидов доказывают при помощи разделения извлечения из корня женьшеня в тонком слое силикагеля и последующим проявлением хроматограммы раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты при нагревании. Панаксозиды проявляются в виде розовых пятен.

Единого метода количественного  определения сапонинов в лекарственном  растительном сырье нет.

Чаще всего используют физико-химические методы:

1.Потенциометрический метод. Метод основан на определении изменения электродвижущей силы (ЭДС) в результате титрования. Метод используется для определения суммы аралозидов в корнях аралии маньчжурской.

Этапы определения:  - подготовительный;    экстракция аралозидов метиловым спиртом и    их кислотный гидролиз:

 

 

 

R1, R2 – сахара    олеаноловая кислота

 

-  очистка от сопутствующих  веществ - осаждение олеаноловой кислоты в результате смены растворителя (разбавление спиртового извлечения водой и охлаждение);

-  растворение олеаноловой кислоты в горячей смеси метилового и изобутилового спиртов (1:1,5);

- количественное определение  - титрование раствором едкого  натра (0,1 моль/л) в смеси метилового спирта и бензола:            

Точку эквивалентности определяют потенциометрически.

2.  Спектрофотометрический метод. Метод основан на способности сапонинов и их окрашенных комплексов поглощать монохроматический свет при определенной длине волны. (в основном для диоскории ниппонской. Проводят кислотный гидролиз сапонинов с последующим проведением реакции свободного агликона (диосгенина) с реактивом (п-диметиламинобензальдегид), образуется окрашенный комплекс; и для корней солодки. Проводят осаждение глицирризиновой кислоты концентрированным раствором аммиака. Осадок растворяют и определяют оптическую плотность полученного раствора.

3. Гравиметрический метод  - определение экстрактивных веществ.  Метод основан на определении  сухого остатка после высушивания  суммы веществ,  извлеченных из  сырья соответствующим экстрагентом. Метод предложен для оценки качества сырья женьшеня, почечного чая, синюхи голубой, солодки.

4. Ранее для количественной  оценки сырья использовали определение гемолитического индекса и пенного числа.

Количественное определение  сапонинов гемолитическим методом основано на предположении, что гемолитическое действие прямо пропорционально количеству вещества в растворе.

Гемолитический индекс –  наименьшая   концентрация извлечения из сырья, которая вызывает полный гемолиз  эритроцитов. Для этого к настою сырья на изотоническом растворе добавляют 2% взвесь бараньих эритроцитов. В результате гемолиза кровь становится прозрачной, ярко-красной, лакированной (эритроциты перейдут в плазму). Расчет проводят на 1 г испытуемого вещества.

5. Пенное число – наименьшая  концентрация извлечения из 1 г сырья, при встряхивании которого в течение 15 секунд образуется пена, устойчивая  в течение 15 минут.

6. Определяли  силу действия  сапонинового сырья на рыбах, то есть рыбный индекс. Это наименьшая концентрация извлечения, при которой гибнут рыбы массой до 0,5 г, длиной 3-4 см в течение 1 часа.[9]

        При выяснении структуры  сапонинов  помимо традиционных методов (элементарный анализ,  определение  молекулярной массы) широко используются методы УФ-спектроскопии, ИК-спектроскопии, Ямр-спектроскопии.

       ИК- спектроскопия при исследовании тритерпенов применяется для обнаружения и характеристики двойных связей, гидроксильных групп, О-ацильных группировок, карбонильных, карбоксильных, метильных групп.

По характерным полосам  поглощения CH₃-групп в области 1245-1392 см^-1 отличают тетрациклические тритерпены от пентациклических групп альфа- и бета- амирина, а также последние друг от друга. По ИК спектрам продуктов окисления оксидом рутения (1У) предложен метод доказательства положения изолированной двойной связи в тритерпенах.

Строгое отнесение  сапонинов  к стероидам может быть сделано на основании ИК спектров и их генинов: наличие полос поглощения при 852(866), 900 (900), 922(922), 987 (982) см^-1 (спирокетальная группировка нормального и изо-(рядов) позволяет однозначно отнести  сапонины  к стероидному ряду.

      В последнее время при исследовании структур пентациклических тритерпенов получила распространение масс-спектрометрия и методы ЯМР спектроскопии.

       Установление строения углеводного остатка тритерпеновых и стероидных  сапонинов  осуществляется с помощью методов структурной химии олиго- и полисахаридов. Сюда входит: 

-определение  качественного и  количественного  состава моносахаридов;

установление последовательности моносахаридных остатков в углеводной цепи;

- определение  положения гликозидных связей в моносахаридных остатках;

- определение  размеров оксидных циклов моносахаридов;

-установление конфигурации гликозидных центров.[8]

Веществами, определяющими  фармакологическое действие корней  женьшеня и препаратов из них являются, являются тритерпеновые гликозиды даммаранового ряда и олеанолового ряда, названные гинсенозидами. В связи с этим важным показателем качества корней и настойки должно быть содержание суммы гинсенозидов.

Для определения гинсенозидов широко используют методы ВЭЖХ, комбинированные методы, сочетающие тонкослойную хроматографию с денситометрией или флуориметрией, методы спектрофотометрии. Стандартизацию качества корней и настойки женьшеня проводят по сумме экстрактивных веществ – по сухому остатку.

Рассмотрев общие возможные методы качественных реакций и количественного определения, перейдем к частным методам стандартизации.

Методика  определения суммы гинсенозидов в женьшене корнях и настойке. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5  50 мл, прибавляют 15 мл. Около 0,3 г сырья помещают в круглодонную колбу с притертой пробкой вместимостью 50 мл, прибавляют 15 мл 70% спирта, закрывают пробкой и взвешивают. Оставляют в темном месте на 1 ч, затем кипятят на водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч. Потерю в массе после кипячения восполняют спиртом, оставляют в темном месте и фильтруют через бумажный фильтр в сухую колбу (извлечение корня).