Клинлабдиагностика

Клинические лабораторные методы исследований  Кафедра ВНБ, КД и Ф/Курс лекций

 

ВВЕДЕНИЕ

В медицине и ветеринарии широко используются многочисленные общие клинические, гематологические, биохимические, биофизические, химикотоксикологические и другие методы исследования крови, мочи, молока, содержимого рубца, желудка, кишечника, печени, почек и т. д. Без этих методов немыслимы оценка состояния обмена веществ, функций отдельных органов и систем, постановка диагноза, контроль за эффективностью лечения. Использование унифицированных методов также необходимо при выполнении научных исследований в области ветеринарии, зоотехнии, биологии.

Диспансеризация животных, позволяющая осуществлять контроль за состоянием обмена веществ и здоровья в целом по стаду, своевременно выявлять преобладающие и сопутствующие болезни, их причины, основана, прежде всего, на использовании клинических лабораторных методов исследования. Без лабораторных диагностических тестов невозможно представить сущность патологического процесса, ход течения болезни, ее исход, доказуемость терапии.

Поскольку причины многих неинфекционных болезней животных, которые составляют более 80-85 % в структуре общей заболеваемости - недоброкачественные корма необходимо знать методы оценки качества кормов и их стандарты. Учитывая широкое распространение отравлений животных - методы определения фосфорорганических соединений (ФОС), синтетических перитроидов, родентицидов, микотоксинов, алкалоидов, цианогенов и других ядовитых веществ.

Особое место занимают методы исследования содержимого рубца, так как без оценки состояния рубцового пищеварения невозможно понять исходные механизмы многих патологических процессов в организме, разобраться в этиологических факторах.

Унифицированные лабораторные методы исследования отвечают требованиям по специфичности, правильности, воспроизводимости, чувствительности, допустимым пределам аналитической погрешности.

Точность и ценность получаемых результатов исследования зависят от многих факторов:

• выбора метода
• подготовки посуды
• реактивов
• особенно калибровочных материалов
• условий взятия
• транспортировки
• подготовки и хранения образцов биологического или другого материала
• использования антикоагулянтов
• консервантов, замораживания, оттаивания при его подготовке
• работы приборов
• качества и добросовестности выполнения анализа.

 

При исследовании учитывают однородность групп животных, их возраст, пол, клиническое состояние, время взятия образца и целый ряд экзогенных факторов (условия кормления, климат, температуру и влажность среды, возможное воздействие химических и биологических средств и т. д.).

Введение в практику унифицированных методов исследования упорядочивает работу лаборатории и отдельных исследователей, делает сопоставимыми результаты различных учреждений и отдельных исследователей, способствует совершенствованию лабораторного дела в целом.

СОКРАЩЕНИЯ

АлАТ -  аланинаминотрансфераза

АОА -  антиокислительная активность

АсАТ -  аспартатаминотрансфераза

АТФ -  аденозинтрифосфат

БАВ -  биологически активные вещества

ГГТ -  гамма-глутамилтранспептидаза (гамма-глутамилтрансфераза)

(ГГФ)

ГЖХ -  газожидкостная хроматография

ДДВФ -  диметилдихлорвинилфосфат

КК -   креатинкиназа

КФК -  концентрационный фотоколориметр

ЛДГ -  лактатдегидрогеназа

ЛП -   липопротеиды

ЛПВП -  липопротеиды высокой плотности

ЛПЛ -  липопротеидовая липаза

ЛПНП -  липопротеиды низкой плотности

ЛПОНП -  липопротеиды очень низкой плотности

МДУ -  максимально допустимый уровень

НАД -  никатинамидадениндинуклеотид

НЭЖК -  неэтерифицированные жирные кислоты

ОЭ -   обменная энергия (коэффициент)

ПОЛ -  перекисное окисление липидов

ПХ -   пероксидаза хрена

ТДФ -  тиаминдифосфат

ТМБ -  тетраметилбензидин

ТСХ -  тонкослойная хроматография

ТТГ -  тириотропный гормон

ХМ -   хилимикрон

ФЛ -   фосфолипиды

ЦТК -  цикл трикарбоновых кислот

 

 

 

ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АППАРАТУРЫ В ЛАБОРАТОРНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ

 

В клинической лабораторной диагностике чаще всего применяют приборы двух групп:

1) для оптических измерений (оптоэлектрические);

2) для электрохимических измерений.

Во всех случаях аппаратура, предназначенная для получения количественного результата, должна проходить метрологический контроль.

К приборам первой группы относятся приборы, применяемые для различных измерений:

• светопоглощения (абсорбции света) - колориметры и спектрофотометры;
• флуоресценции - флуориметры и спектрофлуориметры;
• оптической активности растворов (вращение плоскости поляризации света) - поляриметры;
• интенсивности светоизлучения (интенсивности окраски пламени, эмиссии) - пламенные фотометры;
• поглощения света раскаленными газами - атомные абсорбциометры;
• светорассеяния (мутные суспензии и эмульсии – нефелометры и турбидиметры).

К приборам второй группы относятся:

• различные типы потенциометров, включая pH-метры; полярографы;
• приборы для измерения показателей кислотно-щелочного состояния;
• группа устройств (датчиков с терминалами) для непрерывного контроля таких параметров внутренней среды организма, как рО2, глюкозы и т. д.

Отдельной группой стоят более сложные приборы, совмещающие две функции: препаративную и измерительную. К таким аппаратам относятся хроматографы и приборы для электрофореза.

Во многих лабораторных измерительных устройствах имеются приспособления для облегчения работы лаборанта. В некоторых из них эти устройства доведены до уровня автоматических анализаторов. Последние могут быть или непрерывными, или дискретными. Непрерывный автоматический анализатор обрабатывает все пробы, как на конвейере, дискретный - сериями.

В обоих случаях автоматические анализаторы оборудованы компьютерами.

Колориметры, спектрофотометры и турбидиметры работают по одинаковому принципу - принципу фотометрии: сравнению интенсивности падающего на кювету света с измеряемым образцом (раствором, суспензией, эмульсией) с интенсивностью света, прошедшего через кювету.

В нефелометрах используется сравнение интенсивностей падающего и рассеянного («вбок», вследствие эффекта Тиндаля) света.

Для сравнения используют либо отношение интенсивностей, либо десятичный логарифм их отношения.

Современные фотометры могут быть предназначены как для работы в области видимой части оптического спектра (400-700 нм), так и для УФ - ультрафиолетовой (200-400 нм) и ИК – инфракрасной (700-3000 нм).

 

 

КОЛОРИМЕТРЫ

Наиболее просты по конструкции и правилам эксплуатации колориметры - приборы, предназначенные для измерения интенсивности окраски растворов и решения некоторых близких задач. При фотометрировании цветных растворов в диапазоне оптических плотностей, не превышающих 2 (иногда 0,4), оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации окрашивающего раствор вещества.

Во всех современных колориметрах используется фотоэлектрическая регистрация интенсивности света, прошедшего через кювету с образцом, поэтому их называют фотоэлектроколориметрами (ФЭК) или концентрационными фотоколориметрами (КФК). В большинстве случаев фотоэлектроколориметры оборудованы комплектом сменных светофильтров, что позволяет проводить измерения в широком диапазоне фиксированных значений длин волн света падающего на кювету с образцом. Возможность выделения нужного участка спектра в некоторых колориметрах решена путем использования широкополосных светофильтров, в других - узкополосных - интерференционных (10-20 нм).

Фотоэлектрический сигнал с фотодетекторов через усилитель обычно поступает либо на аналоговый терминал (показывающий стрелочный прибор), либо на цифровой; во многих современных колориметрах также предусмотрена возможность сопряжения с цифровым вольтметром, аналоговым регистрирующим прибором (самописцем), цифропечатающим устройством (ЦПУ), а также с ПЭВМ. В последнем случае в позициях каталога, соответствующих таким приборам, указывается «с RS-232-интерфейсом». Обычно дополнительные регистрирующие устройства используют в тех случаях, когда требуются кинетические измерения.

Для сравнения интенсивностей падающего и прошедшего света используют сравнение интенсивностей света, прошедшего через кювету с образцом (I) и кювету сравнения (I0), в которой находится чистый растворитель. Кюветы, разумеется, должны быть идентичны. Поэтому сами измерения сводятся к тому, что сначала под луч света помещают кювету сравнения и специальными органами регулировки добиваются значения сигнала, соответствующего 100 % шкалы прибора. Затем под луч помещают исследуемый образец, и в этом случае показание прибора уже соответствует величине пропускания контролируемого раствора (Т, %), т. е.

T= I / I0 х 100

Во многих случаях аналоговые терминалы снабжены второй шкалой, оцифрованной не в процентах, а в единицах оптической плотности (D). Оптическая плотность с пропусканием связана соотношением

D = -Ig (Т)

Разумеется, здесь пропускание выражается не в процентах, а в виде десятичной дроби. С концентрацией поглощающего вещества при условии, что в растворе нет других веществ, поглощающих в той же спектральной области, оптическая плотность связана соотношением

D=KC,

где К - коэффициент пропорциональности, зависящий от размеров кюветы и свойств поглощающего вещества; С - молярная концентрация.

Поэтому для количественного анализа колориметрическим методом (точнее фотометрическим, так как измерения могут проводиться в ультрафиолетовой или ближней инфракрасной областях, где никакой видимой окраски нет) удобнее пользоваться калибровочными графиками, заранее построенными с помощью колориметроэталонных растворов.

При определении светофильтра для колориметрии окрашенного раствора следует выбирать такую длину волны падающего света, которая соответствует максимальному поглощению пигмента. Можно воспользоваться таблицей 1. При работе с растворами, поглощающими в ультрафиолетовой или инфракрасной областях, данные таблицы 1 непригодны и следует руководствоваться либо готовой методикой, либо предварительным, экспериментальным поиском подходящей спектральной области. При этом следует учитывать, что при работе в области длин волн ниже 340 нм обычные стеклянные кюветы непригодны и необходимы кюветы из специальных сортов стекла (увиолевые) или кварцевые.

 

Наиболее распространены отечественные колориметры КФК-2однолучевой, с аналоговым терминалом, дополнительным выходом для подключения цифрового вольтметра и КФК-3, отличающийся от КФК-2 цифровым терминалом, выходом для подключения ЦПУ и монохроматором вместо набора сменных светофильтров. Оба колориметра работают в диапазоне от 315 до 980 нм. Используют также различные импортные колориметры всех типов.

 

Таблица 1 - Длины волн спектра и соответствующие им окраски

Длина волн поглощаемого света, нм	Цвет поглощаемого излучения	Дополнительный цвет (наблюдаемый цвет раствора)
400-480	Фиолетовый	Желто-красный
435-480	Синий	Желтый
490-500	Сине-зеленый	Красный
500-560	Зеленый	Пурпурный
560-580	Желто-зеленый	Фиолетовый
580-595	Желтый	Синий
595-605	Оранжевый	Зеленовато-синий
605-730	Красный	Сине-зеленый
730-760	Пурпурный	Зеленый