Трансплантация эмбрионов

После ветеринарных обработок коров и телок для  трансплантации эмбрионов их можно  использовать только через 3 недели. На каждого донора следует готовить 5-6 реципиентов.

Диагностика стельности реципиентов проводится ректальным методом спустя 2-3 месяца после эмбриопересадок.

Кормление доноров  и реципиентов должно быть биологически полноценным. Недостаточный уровень  кормления, несбалансированность рациона  по общей питательности и другим жизненно важным элементам, использование  кормов низкого качества ведут к  нарушению обмена веществ, что оказывает  отрицательное влияние на эффективность  гормонального вызывания суперовуляции, качество полученных эмбрионов и  их приживляемость.

2.2 Методы гормонального вызывания суперовуляци. 

После отбора доноров приступают к индуцированию множественной  овуляции (суперовуляции). Этот метод разработан в СССР, и обуславливает синхронный рост фолликулов в яичниках при введении гонадотропинов не позднее 50 дня с момента отела. Оптимальный результат – выход минимум 10-20 яйцеклеток. На момент введения гормонов в яичнике должно быть много мелких фолликулов, при наличии одного большого или нескольких результат обработок сводится к нулю. Нужно учитывать и то, что фолликулы растут асинхронно, поэтому обработку гонадотропинами проводят в несколько этапов.

Для вызывания суперовуляции  у крупного рогатого скота используются гонадотропные препараты: гонадотропин сыворотки жеребых кобыл - ГСЖК и фолликулостимулирующий гормон - ФСГ - гипофиза животных, для синхронизации половых циклов - аналоги простагландина Ф2-альфа (эстрофан, магэстрофан, клопростенол, суперфан, ремофан, клатрапростин, эстуфалан и др.). Препараты ГСЖК обладают комплексной фолликулостимулирующей и лютеинизирующей активностью. Период полураспада экзогенного ГСЖК у коров составляет около 6 дней. Соотношение ФСГ и ЛГ в различных партиях неодинаковое, что сказывается на результативности суперовуляции. Стимуляция роста фолликулов препаратами ГСЖК сопровождается, как правило, увеличением массы яичников, образованием после овуляции разного числа и величины желтых тел. Из-за длительного распада ГСЖК в крови животных накапливаются повышенные концентрации гормонов. Изменение эндокринного статуса при индукции суперовуляции может оказывать неблагоприятное действие на оплодотворяемость яйцеклеток, развитие зародышей, а также на физиологическое состояние половых органов (в частности, наблюдается кистозное перерождение яичников). Для исключения длительной стимуляции роста фолликулов применяется анти-СЖК. Обработка антисывороткой в день проявления охоты нейтрализует циркулирующую в крови животных ГСЖК и тем самым прекращает дальнейшую стимуляцию роста фолликулов в яичниках. Это создает более благоприятный фон для овуляции, оплодотворяемости яйцеклеток и последующего развития зародышей. В практике используются стандартные гонадотропные препараты высокой степени очистки: сергон (Чехия), фоллигон (Голландия), прегмагон (Германия). Эти препараты инъецируют донорам на 11-12-ый день полового цикла, однократно, в дозе 50 И.Е. на 100 кг живой массы животного. Применение этих гонадотропинов обеспечивает вызывание множественной овуляции у 75-78% животных и получение в среднем 3,5-4,0 жизнеспособных эмбриона на донора.

Опыт работы по вызыванию  суперовуляции у коров-доноров  сывороточными и гипофизарными  препаратами показал, что при  использовании гипофизарных гормонов (ФСГ-п, ФСГ-супер, фолликотропин, фоллитропин) получаются более стабильные и высокие  результаты суперовуляции и эмбриопродукции (таб.1). Так, процент коров-доноров, реагирующих на обработку сывороточными гонадотропинами, составил 75,0-78,3%, гипофизарными препаратами - 85,3-88,8%, число овуляций на донора - соответственно 8,3-9,7 и 10,2-12,0, количество пригодных эмбрионов - 3,5-4,0 и 5,5-6,1. 

Залогом эффективного применения метода трансплантации эмбрионов  в практике племенной работы являются высокие показатели овулирующей реакции яичников коров-доноров на гонадотропные обработки и выход достаточного числа качественных эмбрионов. Высокая вариабельность и непредсказуемость как по числу вызванных овуляций, так и по количественному и качественному составу извлеченных зародышей создают трудности в планировании программы пересадок эмбрионов реципиентам и ведут к повышению затрат на трансплантацию.

В связи с этим, для совершенствования схем индукции полиовуляции у коров-доноров требуется  изыскания новых подходов к решению  этой проблемы, разработки эффективных  препаратов, позволяющих получать хорошие  результаты по выходу эмбрионов.

Изучена эффективность  гонадотропина ФСГ-Б, полученного  в лаборатории генетики БелНИИЖ, и рекомендуется для практики следующая схема его применения: начало гормональной обработки 10-12-й  день полового цикла; суммарная доза – 1500-1650 ИЕ на одного донора; инъекция простагландина F2-α на 3-й день обработки  в дозе 750 мкг.

Инъекция гонадотропина  ФСГ-Б по предложенной схеме позволяет  получать в среднем на донора 10-11 овуляций, 7,2-8,1 эмбриона, в том числе 5,2-5,5 полноценных.

Таблица 1 - Результаты суперовуляции и эмбриопродукции доноров при использовании разных гонадотропинов

В то же время использование  вышеперечисленных гонадотропинов при индукции полиовуляции не исключают  образования на яичниках неовулировавших  фолликулов, наличие которых может  привести к нарушениям гормонального  статуса доноров. С целью исключения длительной стимуляции роста фолликулов и наступления равномерной овуляции рекомендуется использовать синтетические  аналоги гонадотропин рилизинг-гормона (Гн-РГ). Инъекция донору Гн-РГ (сурфагон, диригистран и др.) в день охоты  способствует выделению лютеинизирующего гормона и овуляции фолликулов в  фиксированное время. 

Многолетний опыт нашей  работы показал, что инъекция Гн-РГ в 2-3 раза снижает число неовулировавших  фолликулов, повышает на 6-9% количество овуляций и на 11-19% число эмбрионов, пригодных к пересадке, в расчете  на одного донора. 

2.3 Синхронизация половых циклов доноров и реципиентов.

Синхронность проявления эструса между донором и реципиентом - важнейшее условие высокой приживляемости эмбрионов. Для синхронизации охоты используют простагландин ПГФ2-альфа или его синтетические аналоги (эстрофан, магэстрофан, ремофан, клопростенол, клатрапростин, суперфан, эстуфалан и др.).

По технологии трансплантации на каждого донора следует подготавливать не менее 5 реципиентов, причем день охоты  реципиента должен совпадать с днем первого осеменения суперовулирующего  донора. В случае использования в  технологии трансплантации постоянных доноров (проверенных на гормональную обработку и имевших стабильный выход качественных эмбрионов) число  реципиентов можно увеличить  до 10.

Перед гормональной обработкой животных исследуют ректально (определяют размеры и форму яичников, наличие и выраженность желтого  тела). Лютеиновая фаза цикла соответствует  оптимальному времени для инъекции препаратов. Простагландины вводят внутримышечно  в дозах, указанных в наставлениях по их применению. Как правило, животные приходят в охоту через 48-72 часа после  инъекции препарата. Не пришедших в  охоту животных обрабатывают повторно через 10-11 дней с момента первого  введения ПГФ2-альфа. Двукратное введение препарата (в любую фазу полового цикла) с 10-ти дневным интервалом эффективно использовать на большом поголовье  доноров и реципиентов, так как  это способствует увеличению числа  животных, проявивших признаки половой  охоты, и снижает трудоемкость операций обслуживающего персонала.

Эффективен способ синхронизации эструса у доноров  и реципиентов путем комплексного использования в лютеиновой фазе полового цикла инъекций гонадотропина  с простагландином Ф2 и гонадотропин рилизинг-гормоном. Животных, имеющих  хорошо выраженное желтое тело, обрабатывают ФСГ-супер в общей дозе 10 Арм.ед. для телок и 15 Арм.ед. для коров  двукратно по 5-7,5 Арм.ед. через 12 часов, на следующий день однократно инъецируют эстрофан по 500 мкг, а через 60 часов  от момента введения эстрофана дополнительно  сурфагон по 25 мкг. Половая охота  у животных проявляется на 2-3 сутки  после введения простагландина.

Следует учитывать, что данные обработки осуществляются не параллельно: доноров обрабатывают за 15 дней до начала стимулирования суперовуляции, а реципиентов – на второй день после начала стимулирования суперовуляции  у доноров.

Исследованиями  установлено (табл. 2), что комплексное  использование гормональных препаратов ФСГ, ПГФ2альфа Гн-РГ для синхронизации  эструса у самок крупного рогатого скота существенно повышает эффективность  работ по трансплантации. Из 50 телок, обработанных в опыте, клинически выраженную охоту проявили 88% животных, что на 11,4% больше, чем в контроле, а число реципиентов, пригодных для эмбриотрансплантации, и приживляемость пересаженных зародышей увеличилась соответственно на 15,0 и 12,2%.

Таблица 2 - Эффективность  способов подготовки животных для эмбриотрансплантации 

Аналогичная закономерность наблюдалась по группе коров-доноров. Количество животных, пригодных для  использования в качестве доноров, увеличилось на 15,5, а число коров, положительно реагирующих полиовуляцией, на – 14,8%. В опытной группе по сравнению  с контрольной повысился выход  полноценных эмбрионов от донора на 24% , а выход зародышей, пригодных  для пересадки, от общего числа извлеченных  зародышей -–14,7%. 

Таким образом, комплексное  использование гормональных препаратов для синхронизации эструса самок  крупного рогатого скота позволяет  повысить количество телок-реципиентов и коров-доноров, пригодных для эмбриотрансплантации, соответственно на 15 и 15,5%, уровень приживляемости зародышей – на 12,2%, выход полноценных эмбрионов от числа извлеченных – на 14,7%. 

2.4 Осеменение коров – доноров.

Результаты суперовуляции  определяются эффективным осеменением  животных-доноров. Проблема оплодотворения яйцеклеток и получения биологически полноценных эмбрионов все еще  остается открытой.

Для определения эффективности  осеменения животных-доноров используют как свежую, так и замороженную сперму. Эффективность осеменения доноров  свежей спермой выше по сравнению  с осеменением глубокозамороженной. Это различие объясняется главным  образом тем, что сперматозоиды, не подвергавшиеся охлаждению, сохраняют  всю активность в половых путях  животных более длительное время, чем  после оттаивания. Однако учитывая большие преимущества осеменения коров  глубокозамороженной спермой оцененных  быков-производителей, в практике используют именно  такую сперму.

При осеменении доноров применяют  цервикальный метод введения спермы, используя один из трех способов ее введения в шейку матки: ректо-цервикальный, моно-цервикальный и визо-цервикальный. Осеменение наиболее предпочтительно  производить ректо-цервикальным способом, позволяющим контролировать состояние половых органов коров.

Искусственное осеменение предотвращает  распространение целого ряда заболеваний. Уровень оплодотворения после осеменения несуперовулирующих животных глубокозмороженной спермой составляет 85-95 % и только 60-80 % яйцеклеток, извлекаемых из суперовулировавших животных-доноров, является оплодотворенным.

Осеменение доноров производят 3 раза двойной дозой глубокозамороженно-оттаянной  спермой с интервалом 10-12 ч, точно  фиксируя при этом время прихода  в охоту. Замороженную сперму используют после оттаивания при подвижности  спермиев не менее 4 баллов. В дозе спермы для осеменения должно быть не менее 50 млн. подвижных спермиев.